Utarbeidelse av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision

Summary

Protokoller for enkelt nevron microfluidic Oppstillings og vann maskering for i-chip plasma fordelingen av biomateriale belegg er beskrevet. Meget sammenhengende co-kulturer kan være forberedt på å bruke minimalt med celle innganger.

Abstract

Microfluidic utførelser av Campenot kammeret har tiltrukket seg stor interesse fra nevrovitenskap samfunnet. Disse sammenhengende co-kultur plattformer kan brukes til å undersøke en rekke spørsmål, som strekker seg over utviklingsmessige og funksjonelle nevrobiologi for smitte og sykdom forplantning. Men konvensjonelle systemer krever betydelige cellulære innganger (mange tusen per rom), utilstrekkelig for å studere lav overflod celler, slik som primær dopaminerge substantia nigra, spiral ganglier, og Drosophilia melanogaster nevroner, og upraktisk for høy gjennomstrømming eksperimentering. Den tette kulturer er også svært lokalt viklet, med noen utvekster (<10%) sammenhengende de to kulturene. I dette papiret enkle microfluidic og mønster protokoller er beskrevet som løse disse utfordringene: (i) en microfluidic enkelt nevron arraying metode, og (ii) en vann maskering metode for plasma mønster biomateriale belegg for å RegiSter nevroner og fremme utvekst mellom avdelinger. Minimalistic neuronale ko-kulturer ble fremstilt med høyt nivå (> 85%) intercompartment tilkobling og kan anvendes for høy gjennomstrømning neurobiology forsøk med enkeltcelle presisjon.

Introduction

Nevronale vev er svært sammensatt; en heterogen celle blanding som er romlig organisert innenfor definerte lag og avdelinger, og med plast tilkobling via celle kontakter og spesielt via axon og dendrite utvekster. Nye teknikker er nødvendig for å gi større eksperimentell frihet til å få dypere innsikt og avdekke mekanismene er sentrale for sykdom, utvikling og sunn funksjon. Den Campenot kammeret ^1,2 og mer nylig microfabricated utførelses ^3,4 kan anvendes for ex vivo fremstilling av nettverks neuronale ko-kulturer med evne til selektivt å forstyrre de forskjellige somatiske populasjoner og også deres neurite utvekster. Disse microfluidic enheter har for eksempel blitt brukt til å studere axon degenerasjon og regenerasjon følgende kjemiske ^5,6 eller laser axotomy ^6-8, tauopathy ^9, viral spredning ^10,11, og mRNA lokalisering i axons ^fire.

ent ">

For å utvide rekkevidden av nevrobiologer, er den teknologiske utviklingen som kreves for å forberede minimalis nevrale co-kulturer. Dette gjør det mulig floke av nevronale nettverk for etterforskningen av systemet med én celle og sub-cellulære presisjon. Kravet til minimale celletall åpner muligheten for å analysere sjeldne celletyper, inkludert substantia nigra dopaminerge celler som er relevante for Parkinsons sykdom, spiral ganglia fra øret, perifere nerveceller, og stamceller. Utover dette, er mobilnettet økonomi relevant for 3Rs initiativet. Ved hjelp av disse microfluidic plattformer, storskala toksisitets skjermer eller annen høy gjennomstrømning, kan data rik eksperimentelle serien krever dyre nevroner nå vurderes.

I dette papir protokoller for fremstilling og bruk av en mikrofluidenhet er beskrevet. Microfluidic Oppstillings i kombinasjon med en in situ biomaterial mønster metoden kan brukes for registrering av sterkt sammenhengende neuronale ko-kulturer ved bruk av minimale antall celler. Microfluidic oppstillings er basert på en differensialstrømnings tilnærming ^12-15, idet mikrostrukturerte feller er plassert innenfor et fluidic krets (illustrert sammen med SEM-bilder i figur 1). Banen 0 → 1 har det nedre fluidic motstand (R _2> R ₁₎ for transport av neuroner på en lineær oppstilling av mikrostrukturerte åpninger – inntakene til de neurite utvekst kanaler. Occupancy av fellen av en enkelt celle lokalt hindrer flyten å avlede strømlinjene for fangst påfølgende celler i nabo feller. Fullstendig belegg av fellene i matrisen kopler fluidic forholdet _(R1> R ₂₎ for å avlede strømlinjene i det serpentinbane (0 → 2) for å frembringe en bypass-modus for operasjonen for fjerning av overskytende neuroner.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figur 1 Microfluidic Circuit.. A) Den differensielle motstand fluidic krets for enkelt neuron oppstillings, med flankekulturkamre sammen av neurite utvekst kanaler. B, C) ​​SEM bilder av bilayer compartmentalized neuron ko-kultur matrise med menisk låsing micropillars. Med denne designen, ble Trident-formet nevron fangst strukturer brukes til å fremme Fascikulasjoner av neurite utvekster. Figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) ^12. Klikk her for å se større bilde.

Fremstillingen av micropatterned nevrale nettverk på plane underlag kan lett oppnås (for exampl es fra vår gruppe, se Frimat et al. ¹⁶ og Heike et al. ^17). Men innkapsle bioaktive materielle mønstre innen PDMS-enheter og med kravet om mikrometer-skala justering av disse til microfluidic kanalene utgjør en stor teknisk utfordring. I avsnitt 3.1 en protokoll for i-chip, eller in situ, utarbeidelse av biomateriale mønstre presenteres. Disse mønstrene gjør at nervecellen registrering under langvarige kultur tidsrammer og fremme utvekster mellom avdelinger. Menisk-låsing mikrostrukturer brukes til å justere en såkalt vann maske med nervecellen arraying nettsteder og neurite utvekst kanaler. Vannet masken beskytter adhesjonsmolekyl belegg under plasmabehandling, mens det eksponerte overflater er oppløst for å definere biomateriale mønster. I tillegg er protokoller levert for cellekultur, og for fluidic isolasjon som er nødvendig for selektiv behandling av de forskjellige ko-kultur seksjonene.

ve_content "> er Protokollene utviklet for å utnytte brukervennlige prinsipper for myk litografi for replikering av poly (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic enheter ^18. Tilsvarende, i situ biomateriale mønster er grei, utnytte fordampning og overflatespenning fenomener, og bare krever en billig håndplasmakilde. microfluidic kretsen effektivt programmer celle lasting og kupé spesifikke behandlinger gjør disse operasjonene bare et spørsmål om dispensermaterialer inn i riktig bunn port og aspirere ovenfra. På denne måte er det til hensikt å gi neurobiologists frihet til å forberede og bruke microfluidic enheter i egne laboratorier.

Protocol

Protokollene er ment for nevrologer, og er oppsummert i Figur 2. Som sådan er det anbefalt at microfabrication av SU-8 mestere som brukes for PDMS replikering er outsourcet til kommersielle eller institusjonelle fasiliteter. De to lag maske design er fritt tilgjengelig som tilleggsinformasjon (ZIP) på Royal Society of Chemistry nettside 12. Viktigere, bør den første SU-8 lag fremstilles til en dybde på 2,5 til 3,0 mikrometer, og den andre til en dybde på 25 til 30 mikrometer. Dette er s…

Representative Results

Overflatevann maske utnytter spenningen. Trykket toleranse i den luft-væske-grensesnittet skalaer inverst med krumningsradius [ , Produserer svært stabile grensesnitt på microfluidic dimensjoner. De micropillars effektivt forankre vann maske på plass. Vann maskedannelsen er drevet ved fordampning fra microfluidic porter, med frekvensen økes ved oppvarming. Ved hjelp av varmen fra lav forstørrelse (4X – 10X) mikros belysning, ble v…

Discussion

Microfluidic formerings teknikken er den første av sitt slag som gjør presisjon enkelt nevron håndtering for å etablere minimalistiske kulturer. Sammen med in situ biomateriale mønster metode, en kraftig tilnærming for å justere celle mønstre med microfluidic strukturer, disse minimalistiske kulturer har høy intercompartment tilkoblings nivåer med redusert lokal forviklinger. Disse funksjonene kan benyttes for effektiv undersøkelse av inter-transmisjonsseksjonen, og med enkle design modifikasjoner ha…

Materials

PDMS Sylgard 184	Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601	Wacker
Coverslips	VWR	630-1590	130-160 mm thick
3 mm Biopsy Punches	Kai Medical		Handle with care – extremely sharp
Tygon Tubing	Fisher Scientific	S-50-HL	1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix)	Braun	6064204
4-Way Tubing Connector	VWR or Fisher Scientific
Flow Regulator	Harvard Apparatus	722645
0.5 mm Pins	Dressmaking Departments
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
poly-lysine-FITC	Sigma-Aldrich	P3069
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
laminin	Sigma-Aldrich	L2020
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Inverted Fluorescent Microscope
Example Aspiration Pump	KNF Neuberger, Laboport	N811KVP
Hand Held Corona Discharge Device	Leybold-Heraeus, USA	VP23	May not comply with your country's safety standards
Femto Plasma Oven	Diener Electronic
Vacuum Dessicator or Centrifuge