Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula
Summary
Protocolos para único neurônio microfluídicos arraying e mascaramento de água para a padronização dos revestimentos de biomateriais plasma em-chip são descritos. Altamente interligados co-cultura pode ser preparado através de entradas de células mínima.
Abstract
Realizações microfluídicos da câmara Campenot têm atraído grande interesse da comunidade da neurociência. Estas plataformas de co-cultura interligados pode ser usado para investigar uma variedade de questões, abrangendo desenvolvimento neurobiologia e funcional para a infecção e propagação da doença. No entanto, os sistemas convencionais requerem entradas significativas celulares (muitos milhares por compartimento), inadequados para o estudo de células de baixa abundância, como nigra primário dopaminérgico substantia, gânglios espiral, e os neurônios melanogaster Drosophilia e impraticável para a experimentação de alto rendimento. As culturas densas são também altamente enredada localmente, com algumas excrescências (<10%) que interligam as duas culturas. Neste trabalho protocolos microfluídicos e padronização simples são descritos que enfrentar esses desafios: (i) um neurônio único microfluídicos método arraying, e (ii) um método de mascaramento de água para revestimentos de biomateriais padronização de plasma para register neurônios e promover crescimento entre os compartimentos. Minimalista neuronais co-culturas foram preparadas com de alto nível (> 85%) conectividade intercompartimental e pode ser usado para experimentos neurobiologia alto rendimento com precisão uma única célula.
Introduction
Tecido neuronal é altamente complexa; uma mistura heterogênea de celular que é espacialmente ordenados dentro camadas e compartimentos definidos e com conectividade de plástico através de contatos celulares e especialmente via axônio e dendrito excrescências. Novas técnicas são necessárias para conferir maior liberdade experimental para obter insights mais profundos e mecanismos centrais desvendar a doença, o desenvolvimento ea função saudável. A câmara Campenot 1,2 e, mais recentemente, microfabricados concretizações 3,4 pode ser usado para a preparação ex vivo de rede neuronal co-culturas com a capacidade de perturbar selectivamente as diferentes populações somáticas e também as suas excrescências de neurites. Estes dispositivos microfluídicos têm, por exemplo, foram usados para estudar a degeneração de axônios e regeneração seguinte químico 5,6 ou laser axotomia 6-8, tauopathy 9, a disseminação viral 10,11, e localização de mRNA em axônios 4.
ent ">Para ampliar o alcance dos neurobiólogos, os avanços tecnológicos são necessários para preparar minimalistas neuronais co-culturas. Isso permite disentanglement da rede neuronal para a investigação do sistema com uma única célula e precisão sub-celular. O requisito mínimo para o número de células é aberta a possibilidade de analisar os tipos de células raras, incluindo células dopaminérgicas substantia nigra relevantes para a doença de Parkinson, gânglios espirais do ouvido, os neurónios periféricos, e células estaminais. Além disso, a economia celular é relevante para a iniciativa 3Rs. Usando essas plataformas microfluídicos, telas de toxicidade em grande escala ou outra alta taxa de transferência, os dados rico série experimental exigindo neurônios animais já pode ser considerado.
Neste trabalho são descritos os protocolos para a fabricação e uso de um dispositivo micro. Arraying microfluídicos em combinação com um em biomateri situmétodo de padronização al pode ser utilizado para o registro de altamente interconectadas co-culturas de neurônios que usam números de celular mínimos. Arraying microfluídico se baseia numa abordagem de fluxo diferencial de 12-15, em que armadilhas microestruturados são posicionadas dentro de um circuito de fluido (ilustrado, juntamente com imagens de MEV da Figura 1). O caminho 0 → 1 tem a resistência mais baixa de fluidos (R2> R 1) para o transporte de neurónios de um conjunto linear de aberturas microestruturadas – As entradas para os canais de crescimento de neurites. Ocupação da armadilha por uma única célula localmente impede o fluxo para desviar as linhas de corrente para capturar células subseqüentes em armadilhas vizinhos. Ocupação completa das armadilhas na matriz de liga a proporção de fluidos (1 R> R 2) para desviar as linhas de corrente para o trajecto sinuoso (0 → 2) para produzir um modo de operação manual para a remoção de excesso de neurónios.
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Figura 1. Microfluidic Circuit. A) O circuito de resistência diferencial fluídico para arraying único neurônio, com flanquear câmaras cultura interligados por canais de crescimento de neuritos. B, imagens C) SEM da bicamada neurônio compartimentada co-cultura array com menisco fixando micropillars. Com este projeto, as estruturas de neurônio de captura em forma de tridente foram usados para promover fasciculation das excrescências neurite. Figura e lenda reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Clique aqui para ver imagem ampliada.
A preparação de redes neuronais micropatterned em substratos planares pode ser facilmente alcançada (para exampl es do nosso grupo, ver Frimat et al. 16 e Heike et al. 17). No entanto, encapsulando padrões materiais bioativos dentro de dispositivos de PDMS e com a exigência de alinhamento micrômetro escala destes para os canais microfluídicos representa um grande desafio técnico. Na seção 3.1 um protocolo para a em-chip, ou in situ, a preparação de padrões de biomateriais é apresentado. Esses padrões permitem registro neurônio durante prazos longos de cultura e promover outgrowths entre os compartimentos. Microestruturas menisco-pinagem são usados para alinhar uma máscara de água chamado com o neurônio arraying sites e canais de crescimento de neuritos. A máscara de água protege revestimentos moléculas de adesão durante o tratamento de plasma, enquanto que as superfícies expostas são desintegrados para definir o padrão biomaterial. Além disso, os protocolos são fornecidos para a cultura de células e para o isolamento de fluidos necessários para o tratamento selectivo dos diferentes compartimentos de co-cultura.
ve_content "> Os protocolos são projetados para alavancar os princípios user-friendly de litografia suave para a replicação de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos microfluídicos 18. Da mesma forma, em biomaterial situ padronização é simples, explorando de evaporação de superfície e fenômenos de tensão, e só exigindo uma fonte de plasma de mão barato. microfluídicos O circuito de forma eficaz os programas de carregamento do compartimento celular e tratamentos específicos que fazem essas operações simplesmente uma questão de distribuição de materiais na porta inferior correto e aspiração de cima. Desta forma, pretende-se dar os neurobiólogos a liberdade de preparar e utilizar dispositivos microfluídicos em seus próprios laboratórios.Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica arraying microfluídica é o primeiro de seu tipo, que permite a manipulação de precisão único neurônio para o estabelecimento de culturas minimalistas. Juntamente com o método in situ padronização biomaterial, uma abordagem poderosa para alinhar os padrões celulares com estruturas microfluídicos, estas culturas minimalistas têm níveis de conectividade de alta intercompartimental com reduzida emaranhamento local. Estas características podem ser utilizadas para o estudo de eficiência de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricação e Maria Becker (ISAS) para SEM imagem. A pesquisa foi financiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), um Bundesministerium für Bildung und Forschung concessão (BMBF 0101-31P6541) e pelo Ministerium für Inovação, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf graças a Escola Internacional de Leibniz "Biologia de Sistemas Lab-on-a-Chip" de apoio financeiro.
Materials
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
| Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
| 3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
| 1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
| 4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
| Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
| 0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | |||
| Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
| Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
| Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
| Vacuum Dessicator or Centrifuge |
References
- Campenot, R.B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).
- Campenot, R.B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93 (1), 1-12. (1982).
- Taylor, A.M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
- Taylor, A.M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).
- Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
- Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).
- Kim, Y.T., Karthikeyan, K., Chirvi S., & Dave, D.P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons, Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
- Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).
- Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).
- Liu, W.W., Goodhouse, J., Jeon N.L., & Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3 (6), e2382 (2008).
- Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).
- Dinh, N.D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13 (7), 1402–1412 (2013).
- Tan, W.H., & Takeuchi S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).
- Frimat, J.-P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Di Carlo, D. Aghdam, N., & Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).
- Frimat, J.P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
- Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).
- Whitesides, G.M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Haubert, K., Drier, T., & Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6,1548-1549 (2006).
- Frimat, J.P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning, Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).
- Huang, N.P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
- Li, N., & Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).
- Huang, L.R., Cox, E.C., Austin, R.H., & Sturm, J.C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, doi: 10.1098/rsif.2010.0158.focus (2010).
- Brenneman, K.A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3) 238-248 (2000).
- Magalães, A.C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).
- Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).
- Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).
