Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina
Summary
protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.
Abstract
Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l'immunohistochimie et, 2) l'imagerie calcique pour l'étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d'image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.
Introduction
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant 1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique 3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d'au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement extracellulaire auxiliaire α 2 δ de sous-unités et sous-unités β intracellulaires. Les deux derniers complexes sous forme de hétéromères avec différentes sous-unités α 1 et modifier la cinétique de déclenchement et le trafic des canaux à la membrane plasmique 6.
Au cours des dernières décennies, de nombreuses techniques ont été utilisées pour étudier la protéine expression, comme l'immunohistochimie, dosage immuno-enzymatique, une analyse Western et la cytométrie en flux. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques pour la détection d'une protéine d'intérêt donnée et fournissent des outils puissants pour la localisation et la distribution des protéines spécifiques dans différents tissus. Les techniques utilisées pour détecter et quantifier des taux d'une protéine particulière d'expression d'ARNm telles que l'analyse par transfert de Northern, RT-PCR en temps réel quantitative RT-PCR, l'hybridation in situ, des puces à ADNc et essai de protection de ribonucléase offrent une approche alternative lorsque les anticorps ne sont pas facilement disponibles ou si les niveaux d'une protéine particulière d'expression est faible 7. Toutefois, une limitation de l'utilisation de ces techniques moléculaires est l'identification spécifique d'une séquence de gène.
Pour localiser les protéines de la rétine, l'immunohistochimie peut être effectuée sur les rétines wholemount. En raison de l'accessibilité des CGR, le wholemountpréparation fournit une excellente plateforme pour étudier la localisation des protéines spécifiques à la soma RGC et leurs axones.
En plus de leur localisation, des propriétés fonctionnelles des CGR dans VGCCs peuvent être démontrées par l'utilisation de techniques d'imagerie de calcium. Nous décrivons un protocole d'imagerie du calcium pour marquer sélectivement CGR avec un colorant indicateur du calcium à mesurer la dynamique du calcium intracellulaire. La contribution des différents VGCCs au signal de calcium dans différents compartiments cellulaires peut être isolé à l'aide de bloqueurs des canaux Ca-spécifique de sous-typage.
Peut-être l'un des aspects les plus bénéfiques de la technique d'imagerie de calcium décrite ici est la possibilité d'enregistrer en même temps et indépendamment l'un de plusieurs CGR et de leurs axones. Bien que de nombreuses techniques physiologiques, telles que l'enregistrement de l'ensemble de serrage de plaque de cellule, de fournir des enregistrements de haute résolution temporelle des courants membranaires, l'origine somatique ou axonale des thescourants électroniques enregistrées ne peuvent pas être victimes de discrimination et les enregistrements ne peuvent être faites à partir d'un seul neurone à la fois. matrices électrodes multiples (AME) sont capables d'enregistrer en même temps des pointes de nombreuses cellules, mais ne peuvent ni détecter ni discrimination de l'activation, par exemple, les différents sous-types de canaux calciques. Meas préférentiellement enregistrer à partir de cellules qui sont situées à proximité immédiate de l'électrode 8 et enregistrement donné à partir de cellules qui produisent des grandes pointes 9. Méthodes d'imagerie optique fournissent une stratégie alternative pour permettre aux enregistrements simultanés et indépendants des populations entières de cellules qui peuvent être intégrés avec les informations obtenues à partir de micro-électrodes d'une cellule unique et le patch enregistrement de serrage et l'enregistrement de la MEA. Bien que les techniques d'imagerie de calcium décrits ici ont été utilisées pour étudier la dynamique de calcium de CGR, patch clamp et AME peuvent aussi être utilisés en parallèle pour élucider les courants ioniques et les propriétés de dopage de CGR.
<pclass = "jove_content"> Comme les cellules amacrines déplacées représentent environ 60% de la population neuronale dans la couche des cellules ganglionnaires dans la rétine de souris 10, notre objectif était d'utiliser une technique de chargement qui marque sélectivement CGR avec un colorant indicateur de calcium synthétique dans un préparation wholemount. Bien synthétiques colorants indicateurs de calcium fournissent une excellente plate-forme pour l'étude de la dynamique de calcium intracellulaire, son utilisation généralisée a été entravée par l'impossibilité de charger efficacement les populations spécifiques de neurones dans un réseau donné. Beaucoup de techniques telles que le chargement en vrac 11 et l'électroporation 8,12 ont été réalisées pour charger des populations entières de cellules, cependant, ces techniques ne sont pas discriminatoires entre les différents types de cellules spécifiques. Génétiquement codés indicateurs de calcium offrent la possibilité de marquer sélectivement les populations spécifiques de cellules, cependant, de tels procédés exigent la production d'animaux transgéniques 13. Notre technique décrit une méthod étiqueter sélectivement CGR dans la préparation wholemount par fibre injection nerf de la souche d'un colorant indicateur de calcium.Pris ensemble, les techniques structurelles et physiologiques décrites dans cet article fournissent une plate-forme pour étudier la localisation et la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L'immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l'imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.
L'immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine 20-23</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr S. Stella et Helen Vuong à contributions pour le protocole d'imagerie de calcium. Nous remercions le Dr K. Feuilles pour filmer les scènes d'entrevue. Nous remercions le Dr Arlene Hirano pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce projet de recherche et développement a été menée par les auteurs à la David Geffen School of Medicine à UCLA et est rendu possible par un accord de contrat qui a été attribué et géré par le Commandement de la recherche médicale et du matériel de l'armée américaine (USAMRMC) et la technologie de télémédecine et avancée Centre de recherche (TATRC), à Fort Detrick, dans le Maryland, sous le numéro de contrat: W81XWH-10-2-0077. Le soutien à ces études sont également venus de NIH EY04067 et un examen du mérite VA (NB). PNE est une carrière chercheur VA.
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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