Her beskriver vi cellulær cytotoksicitet og enkelt runde infektivitet analyser, som giver mulighed for hurtig og præcis screening af forbindelser for at bestemme deres cellulære cytotoksicitet (CC 50) og IC50-værdier mod WT og resistent HIV-1 lægemiddel.
Selv om der er godkendt en række anti hiv-medicin, er der stadig problemer med toksicitet og resistens. Dette viser et behov for at identificere nye stoffer, som kan hæmme infektion med de fælles lægemiddelresistente HIV-1 stammer med minimal toksicitet. Her beskriver vi en effektiv analyse, der kan anvendes til hurtigt at bestemme den cellulære cytotoksicitet og effektiviteten af en forbindelse over for WT og mutant-virusstammer.
Det ønskede mål cellelinie udsået i en 96-brønds plade, og efter en 24 timers inkubation serielt fortyndinger af forbindelserne, der skal testes tilsættes. Ingen yderligere manipulationer der er nødvendige for cellulær cytotoksicitetsassays; for anti HIV-assays en forudbestemt mængde af enten en WT eller lægemiddelresistent HIV-1-vektor, som udtrykker luciferase tilsættes til cellerne. Cytotoksicitet måles ved hjælp af en ATP-afhængig luminescens assay og virkningen af forbindelser på infektivitet måles ved at bestemme mængden af lucifeRASE i nærvær eller fravær af de putative inhibitorer.
Denne screening assay tager 4 dage at fuldføre og flere forbindelser kan screenes parallelt. Forbindelser screenes i tre eksemplarer og data er normaliseret til infektivitet / ATP i fravær af målforbindelserne. Denne teknik giver en hurtig og præcis måling af effekten og toksiciteten af potentielle anti HIV forbindelser.
Tilgængeligheden af lægemidler rettet mod flere væsentlige trin i HIV-1-virus livscyklus har ført til medicinsk kombinationsbehandling (kaldet højaktiv anti retroviral behandling eller HAART), som har forbedret behandlingen af HIV-1-infektioner, og den langsigtede overlevelse af patienterne. HAART, som typisk anvender kombinationer af to nukleosid revers transkriptase (RT-hæmmere) og enten en proteasehæmmer eller en non nukleosid RT-hæmmer, har nu konverteret en dødelig sygdom ind i en livslang tilstand 1-5. , På trods af de mange succeser HAART i vedvarende undertrykkelse af viral replikation, Men det har begrænsninger. HAART ikke udrydde HIV, så patienterne ikke helbredes, og terapi er livslang. Der er problemer med narkotika toksicitet og med fremkomsten af resistente narkotika stammer. Resistens kan opstå på alle de godkendte anti HIV lægemidler, herunder de nyligt godkendte lægemidler, der er målrettet HIV integrase (IN). Lægemiddelresistens sandsynligvis opstår becabrug af spontane mutationer, der opstår under viral replikation (fejlprocent på 3 x 10 -5 mutationer / base / replikation cyklus) 6.. Når mutationer opstår i gener, der koder for mål for anti retroviral medicin, vil en lille delmængde af disse mutationer fører til en reduktion i følsomhed for den virale stamme til narkotika. For at undgå udvikling af resistens må medikamentkoncentrationer holdes på et niveau, der fuldt undertrykke HIV replikation. Dårlig vedhæftning til det terapeutiske regime forværrer problemet, og kan føre til den hurtige udvikling af resistens 7-9. Selv medikamentkoncentrationer kan variere i patienter på grund af forskellig absorption, metabolisme, fordeling og udskillelse niveauer, kan høje lægemiddelkoncentrationer føre til toksicitet 10. Da behandlingen fortsætter for livet af patienten, der er alvorlige sikkerhedsmæssige bekymringer på lang sigt toksicitet af anti retroviral medicin. Den anti retroviral medicin, der almindeligvis anvendes i HAART kan have negative virkninger ennd der har været hændelser, hvor bivirkningerne er livstruende 11-15. Problemerne patienter støder med udviklingen af resistens og toksicitet ligger til grund for behovet for at udvikle nye lægemidler, der effektivt blokerer replikation af de fælles resistente stammer af viruset med ringe eller ingen langsigtet toksicitet.
Der er således et behov for et assay, der kan screene for forbindelser, der blokerer vigtige skridt i den virale livscyklus hurtigt. Her beskriver vi en effektiv analyse, der kan anvendes til at evaluere cytotoksiciteten af forbindelserne, og deres evne til at blokere replikation af både WT og lægemiddelresistente HIV-stammer hurtigt og effektivt. Analysen vi bruger svarer til et forsøg, der blev udviklet til at screene for resistens i virus isoleret fra patienter 16-18.
Selvom assayet kan anvendes uden modifikation til screening for forbindelser, der kan blokere HIV-revers-transkription, vil vi DescrIBE anvendelse af assayet til at evaluere inhibitorer. I er et essentielt viralt enzym, der indsætter det virale DNA i det cellulære genom 19. Selv om en række lovende inhibitorer udvikles, er hvoraf nogle i øjeblikket undergår kliniske forsøg, kun Isentress 20, 21 (også kendt som Raltegravir eller RAL) og senest, Elvitegravir (EVG) 22 og Dolutegravir (DTG) 23 har været godkendt af FDA. Disse forbindelser er aktive mod både HIV-B og ikke-B-undertyper i cellekultur og hos patienter 24, 25. Men vælger behandling med RAL for multiresistent hiv-1 IN mutanter, herunder Y143R, N155H og G140S/Q148H 24. 26-31. N155H og G140S/Q148H også reducere effekten af EVG, som understreger behovet for at designe og udvikle anden generation i Strand transfer-hæmmere (INSTIs), der er effektive mod disse resistente mutationer.
Vi beskriver en hurtig, effektiv og reproducerbar assay, der kan anvendes til screening af forbindelser for cytotoksicitet og for deres evne til at inhibere replikation af både WT og resistente HIV-1-lægemiddel. Evnen til hurtigt at identificere forbindelser og teste deres effektivitet og cytotoksicitet er afgørende for udviklingen af nye og forbedrede lægemidler mod HIV-1. Når blyforbindelser er identificeret, kan analoger af den ledende forbindelse fremstilles og testes under anvendelse af det samme assay. Assayet er forholdsvis enkel. Der er både positive og negative kontroller, der tillader brugeren at diagnosticere de mest almindelige problemer (giftige forbindelser, problemer med vektorpopulation). Anvendelsen af en tredobbelt sæt brønde uden tilsat forbindelse viser, at der er opstået virusinfektion. Det faktum, at cytotoksicitet måles i en uafhængig analyse undgår misfortolker en reduktion i luciferase forårsaget af cytotoksicitet som en særlig effekt på viral replikation.
De kritiske trini protokollen, er fremstilling af plader, således at cellerne er ensartet fordelt i brøndene, at fordybningerne har de rette koncentrationer af forbindelserne, der skal testes, tilføjer den samme mængde af virus til hver af brøndene, og måling af luciferaseaktiviteten til bestemme CC 50 og IC50-værdier.
Assayet er sikkert, kvantitativ og reproducerbar. Assayet er sikkert, fordi vektoren er replikationsdefekt. Assayet er kvantitativ og reproducerbar, da det er baseret på en enkelt runde vektor, der udtrykker luciferase, der kan analyseres nøjagtigt og bekvemt. I et multi runde virusreplikation assay målte IC50 afhænger af antallet af virale livscyklus; dette er et særligt problem, når assays involverer både WT og resistente virus, der kan have markant forskellige replikation kapacitet.
Der har været flere enzymatiske assays tidligere rapporteret, der kanbruges til at screene for IN-hæmmere. Assays, der involverer real time PCR teknologi til at måle en integreret DNA kræver oprensede rekombinante proteiner (r), og er generelt både mere arbejdskrævende og dyrt 36, 37. Selv om det er muligt at anvende enzymatiske assays til at måle virkningen af forbindelserne på de andre virale enzymer (RT og protease), hvert enzym kræver sin egen assaysystem. Den ene runde vektor assay som beskrevet, kan anvendes uden modifikation til at screene for RT-inhibitorer. En lignende analyse kan anvendes til at screene for proteaseinhibitorer; men i en proteasehæmmer assay forbindelserne skal føjes til de celler, der anvendes til fremstilling af vektorerne. En beslægtet assay ved hjælp af forskellige celler og vektorer, kan også anvendes til at screene for kuvert (env) eller HIV entry fusion inhibitorer. Endelig kan assayet anvendes på en større skala med automatiserede robot dispensere. Således kan assayet anvendes til screening af store biblioteker af forbindelser mod WT og mutant HIV. Men det faktum, at analysen kan detektere en hæmmer af HIV-replikation, der virker på forskellige stadier af den virale livscyklus peger på en begrænsning i fortolkningen af data. Ved selve analysen ikke definere, hvilke trin i livscyklus er blokeret af en forbindelse. Såfremt dette spørgsmål opstår, kan det løses ved hjælp af tidspunktet for tilsætning assays 38, og ved at teste forbindelsen mod oprensede rekombinante virale proteiner.
Desværre, på trods af succesen af anti hiv-medicin, er der stadig problemer med både modstand og toksicitet. I mangel af en effektiv anti HIV-vaccine, er der ikke blot behov for at udvikle nye terapeutiske lægemidler, der vil være effektiv mod de eksisterende resistente mutanter, men også for at udvikle forebyggende medicin, der kan reducere spredningen af virus. Hvis profylaktisk brug af anti hiv-medicin incudes behandling af inficerede mennesker, vil denne tilgang placerer en særlig byrde for at udvikle lægemidler, der har little eller nogen langsigtet toksicitet.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |