Her beskriver vi cellulær cytotoksisitet og enkelt runde smittsomhet analyser som gjør det mulig raskt og nøyaktig screening av forbindelser for å bestemme deres cellulære cytotoksisitet (CC 50) og IC-50 verdier mot WT og legemiddelresistente HIV-1.
Selv om en rekke anti HIV-legemidler har blitt godkjent, er det fortsatt problemer med toksisitet og resistens. Dette viser et behov for å identifisere nye forbindelser som kan hemme infeksjon av de vanlige legemiddelresistent HIV-1-stammer med minimal toksisitet. Her beskriver vi en effektiv assay som kan brukes til raskt å bestemme cellulær cytotoksisitet og effekten av en forbindelse mot WT og mutante virusstammer.
Det ønskede mål-cellelinje er sådd i en 96-brønners plate, og etter en 24 timers inkubasjon i serie fortynninger av forbindelsene som skal testes legges. Ingen ytterligere manipulasjoner som er nødvendige for cellulær cytotoksisitet assays; for anti HIV-analysene en på forhånd bestemt mengde av enten en WT-eller legemiddelresistente HIV-1-vektor som uttrykker luciferase tilsettes til cellene. Cytotoksisitet er målt ved hjelp av en ATP-avhengig luminescens analyse og virkningen av forbindelsene på infektivitet er målt ved å bestemme mengden av luciferase i nærvær eller fravær av de antatte inhibitorer.
Dette screening analysen tar fire dager å fullføre, og flere forbindelser kan bli vist i parallell. Forbindelser som er vist i triplikat, og dataene er normalisert til infectivity / ATP-nivåer i fravær av målforbindelser. Denne teknikken gir en rask og nøyaktig måling av effekt og toksisitet av potensielle anti-HIV-forbindelser.
Tilgjengeligheten av legemidler rettet mot flere viktige skritt i den HIV-1 viral livssyklus har ført til kombinasjonen medikamentell behandling (kalt høyaktiv antiretroviral terapi, eller HAART) som har kraftig forbedret behandling av HIV-1-infeksjoner, og den langsiktige overlevelsen av pasientene. HAART, som typisk bruker kombinasjoner av to nukleosid revers transkriptase (RT) hemmere og enten en proteasehemmer eller en ikke nukleosid RT inhibitor, har nå konvertert en dødelig sykdom til en livslang tilstand 1-5. Men til tross for de mange suksesser av HAART i vedvarende undertrykkelse av virusreplikasjon, har det begrensninger. HAART ikke utrydde hiv, slik at pasientene ikke er kurert og behandlingen er livslang. Det er problemer med narkotika toksisitet og med fremveksten av resistente stammer. Motstand kan oppstå til alle de godkjente anti HIV medisiner, inkludert de nylig godkjente legemidler som mål HIV integrase (IN). Legemiddelresistens sannsynlig oppstår becabruk av spontane mutasjoner som oppstår under virusreplikasjon (feilrate på 3 x 10 -5 mutasjoner / base / replikering syklus) 6. Når mutasjoner oppstår i genene som koder for målene for antiretrovirale medikamenter, vil en liten undergruppe av disse mutasjonene fører til en reduksjon i følsomhet av viral belastning til medikamentene. For å unngå utvikling av resistens, må legemiddelkonsentrasjoner opprettholdes på et nivå som fullstendig undertrykke HIV-replikasjon. Dårlig tilslutning til den terapeutiske behandlingen forverrer problemet, og kan føre til rask utvikling av resistens 7-9. Selv om medikamentkonsentrasjonen kan variere i pasienter på grunn av forskjellig absorpsjon, metabolisme, fordeling og utskillelse, kan høye konsentrasjoner av narkotika føre til toksisitet 10.. Siden behandlingen fortsetter for livet av pasienten, er det alvorlige sikkerhetsmessige bekymringer om den langsiktige toksisitet av anti retrovirals. Den anti retrovirals som vanligvis brukes i HAART kan ha negative effekter ennd det har vært tilfeller der bivirkningene har blitt livstruende 11-15. Problemene pasientene møter med utvikling av resistens og toksisitet har skapt behovet for å utvikle nye medikamenter som effektivt blokkerer replikering av de vanligste legemiddelresistente stammer av viruset med liten eller ingen langsiktig giftighet.
Det er således et behov for en metode som kan screene for forbindelser som blokkerer viktige trinn i viral livssyklus raskt. Her beskriver vi en effektiv assay som kan brukes til å evaluere cytotoksisiteten av forbindelser og deres evne til å blokkere replikasjon av både WT og medikamentresistente HIV-stammer raskt og effektivt. Analysen vi bruker er lik en assay som ble utviklet for å screene for legemiddelresistens i virus isolert fra pasienter 16-18.
Selv om analysen kan brukes uten modifikasjon for screening av forbindelser som kan blokkere HIV revers transkripsjon, vil vi Hei Kjære venneribe ved hjelp av analysen til å evaluere inhibitorer. IN er et essensielt viralt enzym som setter det virale DNA i cellegenomet 19.. Selv om en rekke lovende hemmere er under utvikling, er noen som for tiden gjennomgår kliniske studier, bare ISENTRESS 20, 21 (også kjent som Raltegravir eller RAL) og mer nylig, Elvitegravir (EVG) 22 og Dolutegravir (DTG) 23 har vært godkjent av FDA. Disse forbindelser er aktive mot både HIV-og ikke-B B subtyper i cellekultur, og hos pasienter 24, 25. Men velger behandling med RAL for multiresistent HIV-1 IN mutanter, inkludert Y143R, N155H, og G140S/Q148H 24, 26-31. N155H og G140S/Q148H også redusert effekt av EVG, noe som understreker behovet for å designe og utvikle andre generasjon i Strand overføre hemmere (INSTIs) som er effektive mot disse resistente mutasjoner.
Vi beskriver en rask, effektiv og reproduserbar assay som kan brukes til å screene forbindelser for cytotoksisitet og for deres evne til å hemme replikasjonen av både WT og legemiddelresistente HIV-1. Evnen til raskt å identifisere forbindelser og teste sin effekt og cytotoksisitet er avgjørende i utviklingen av nye og bedre medisiner mot HIV-1. Når blyforbindelser er identifisert, kan analoger av ledningen forbindelsen fremstilles og testes ved hjelp av den samme assay. Analysen er relativt enkel. Det finnes både positive og negative kontroller som tillater brukeren å diagnostisere de vanligste problemene (giftige forbindelser, problemer med vektoren lager). Bruken av et triplikat sett av brønner uten tilsatt forbindelse viser at viral infeksjon har funnet sted. Det faktum at cytotoksisiteten er målt i en uavhengig analyse misinterpreting unngår en reduksjon av luciferase som skyldes cytotoksisitet som en spesifikk effekt på viral replikasjon.
De kritiske trinnenei protokollen blir fremstilling av platene, slik at cellene er jevnt fordelt i brønnene, for at brønnene har de riktige konsentrasjoner av forbindelsene som skal testes, og legger til den samme mengden av virus til hver av brønnene, og å måle luciferase-aktivitet for å bestemme CC 50 og IC 50 verdier.
Analysen er trygt, kvantitativ og reproduserbar. Analysen er trygg fordi vektoren er replikering defekt. Analysen er kvantitativ og reproduserbar, fordi den er basert på en enkelt runde vektor som uttrykker luciferase, som kan undersøkes nøyaktig og bekvemt. I en fler runde virusreplikasjon assay, den målte IC 50 avhenger av antallet av virale livssyklus; Dette er et særlig problem når analysene involverer både WT og medikament-resistente virus som kan ha betydelig forskjellige replikasjonskapasiteter.
Det har vært flere enzymatiske analyser rapportert tidligere at kanbrukes til å screene for IN-hemmere. Analyser som involverer sanntid PCR-teknologi for å måle integrerte DNA krever rensede rekombinante proteiner (e), og er generelt, både mer arbeidskrevende og kostbart 36, 37. Selv om det er mulig å anvende enzymatiske analyser for å måle effekten av forbindelsene på de andre virale enzymer (RT og protease), hvert enzym krever sin egen bestemmelsessystem. Den runde vektor assay, som beskrevet, kan brukes, uten modifikasjon, for å screene for RT-inhibitorer. En lignende analyse kan bli brukt til å screene for protease-inhibitorer; Imidlertid, i en protease inhibitor analysen kan forbindelsene må tilsettes til cellene brukes i fremstillingen av vektorer. En beslektet assay, ved hjelp av forskjellige celler og vektorer, kan også brukes til å screene for konvolutten (env) og HIV-entry-inhibitorer fusjon. Til slutt, kan analysen bli brukt, i større målestokk, med automatiserte robot dispensere. Således kan analysen benyttes for å screene store biblioteker av forbindelser mot WT og mutant HIV. Imidlertid er det faktum at analysen kan detektere en inhibitor for HIV-replikasjon som virker på forskjellige stadier av den virale livssyklus i retning av en begrensning i å tolke dataene. Ved selve analysen ikke definerer hvilke trinn i livssyklusen er blokkert av en forbindelse. Dersom det oppstår dette spørsmålet, kan den løses ved hjelp av tidspunktet for addisjon assays 38, og ved å teste forbindelsen mot rensede rekombinante virale proteiner.
Dessverre finnes det, til tross for suksessen med anti HIV-legemidler, er det fortsatt problemer med både motstand og toksisitet. I fravær av et effektivt anti HIV-vaksine, er det behov for ikke bare å utvikle nye terapeutiske midler som vil være effektiv mot det eksisterende medikament-resistente mutanter, men også for å utvikle profylaktiske medikamenter som kan redusere spredningen av viruset. Hvis profylaktisk bruk av anti HIV medisiner incudes behandling av friske mennesker, vil denne tilnærmingen plassere en spesiell belastning for å utvikle medikamenter som har little eller ingen langsiktig giftighet.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av NCI.
DMSO | Sigma | D2650 | |
DMEM | Corning Cellgro | 10-017 | |
ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System | Perkin Elmer | 6016941 | |
Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6016751 | |
Dulbecco's PBS | Gibco-Life Technologies-Invitrogen | 14190-136 | |
SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | ||
KaleidaGraph | Synergy Software | ||
Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate | Thomas Scientific | 12-566-26 | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Sigma Alrich | T1442-1EA | |
Turbo Dnase | Ambion-Life Technologies-Invitrogen | AM2238 | |
Millex HA Filter Unit, 0.45 µM | Millipore | SLAHA033SS | |
Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit | Perkin Elmer | NEK050B001KT | |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
TZM-bl cells | NIH AIDS Reagent Program | 8129 | |
pNL4.3ΔEnv.LUC | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
VSV-G | NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab | ||
SoftMax Pro | Molecular Devices | 0200-310 |