Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Des progrès considérables ont été réalisés au cours de la dernière décennie vers l'identification et la caractérisation des enzymes impliquées dans la synthèse (des cyclases diguanylate) et de dégradation (phosphodiestérases) du second messager c-di-GMP. En revanche, peu d'informations sont disponibles concernant les mécanismes moléculaires et de composants cellulaires à travers laquelle cette molécule de signalisation réglemente un large éventail de processus cellulaires. La plupart des protéines effectrices connus appartiennent à la famille Pilz ou sont dégénéré cyclases ou phosphodiestérases diguanylate qui ont renoncé à la catalyse et ont adopté fonction d'effecteur. Ainsi, afin de mieux définir le réseau c-di-GMP cellulaire dans un large éventail de bactéries méthodes expérimentales sont nécessaires pour identifier et valider de nouveaux effecteurs pour lesquels fiable dans prédictions in silico sûr.
Nous avons récemment développé une capture nouveau composé spectrométrie de masse (CCMS) technologie comme un outil puissant pourbiochimiquement identifier et de caractériser les protéines de liaison c-di-GMP. Cette technique a déjà été signalé comme étant applicable à une large gamme d'organismes 1. Ici, nous donnons une description détaillée du protocole que nous utilisons pour sonder ces composants de signalisation. A titre d'exemple, on utilise Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste dans laquelle c-di-GMP joue un rôle essentiel dans la virulence et le contrôle du biofilm. CCMS identifié 74% (38/51) des composants connus ou prévus du réseau c-di-GMP. Cette étude explique la procédure CCMS en détail, et l'établit comme un outil puissant et polyvalent pour identifier de nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.
Introduction
c-di-GMP est un second messager clé utilisé par la plupart des bactéries de contrôler différents aspects de leur croissance et leur comportement. Par exemple, c-di-GMP régule la progression du cycle cellulaire, la motilité et de l'expression d'exopolysaccharides adhésines de surface et 4/2. Grâce à la coordination de ces procédés c-di-GMP favorise la formation du biofilm, un processus qui est associée à des infections chroniques d'une gamme de 5 bactéries pathogènes. c-di-GMP est synthétisé par des enzymes appelées CYCLASES diguanylate (DGCS) qui abritent un domaine catalytique GGDEF 4. Certains DGCS possèdent un site inhibiteur qui régule négativement l'activité de cyclase lors de la liaison c-di-GMP. La dégradation de c-di-GMP est catalysée par deux classes distinctes des phosphodiestérases (PDE) hébergeant soit un EAL catalytique ou HD-GYP domaine 6,7.
La majorité des protéines effectrices connus qui se lient directement c-di-GMP appartiennent à l'une des trois classes de protéines: catalytiqueGGDEF ou EAL domaines allié inactifs et domaines Pilz, petits interrupteurs moléculaires qui subissent des changements conformationnels sur c-di-GMP liaison 8. DGCS, PDE et Pilz protéines sont bien caractérisés et leurs domaines peuvent être prédites in silico de façon relativement sûre. Un intérêt particulier est désormais axée sur l'identification de nouvelles classes d'effecteurs c-di-GMP. Certains effecteurs c-di-GMP avec différents motifs de liaison ont été récemment décrits comme le CRP / FNR Bcam1349 de la famille des protéines dans Burkholderia cenocepacia ou FleQ de régulateur transcriptionnel dans P. aeruginosa 9,10. En outre, riboswitchs-GMP-c-di spécifique ont été récemment identifiés et affichés pour contrôler l'expression génique d'une manière c-di-GMP-dépendante 11. Les motifs c-di-GMP de liaison des différents effecteurs sont seulement mal conservée faire des prédictions bioinformatiques de telles protéines difficile. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode biochimique, qui est basé sur l'utilisation d'un spe c-di-GMPcifique de captation composé combinée avec la spectrométrie de masse 1,12,13.
Nous avons récemment conçu un roman trivalent c-di-GMP captation composé (CDG-CC, figure 1) 1. Cet échafaudage chimique est composé de: 1) un fragment C-di-GMP utilisée comme appât pour capturer les protéines de liaison à c-di-GMP, 2) un groupe réactif photoactivable-UV utilisé pour réticuler la CDG-CC pour les protéines liées et 3) une biotine d'isoler les protéines capturées en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Le CDG-CC peut être utilisé pour capturer directement et spécifiquement effecteurs c-di-GMP de mélange complexe de macromolécules que lysats cellulaires. Capturer composé à base de produits chimiques et les approches protéomique base ont déjà été signalés à être applicable à un large éventail d'organismes, par exemple Caulobacter crescentus, Salmonella enterica sérotype typhimurium et P. aeruginosa 1,14.
Dans ce document méthodologique,nous fournissons une dans la description de la profondeur de la procédure CCMS en utilisant des extraits de P. aeruginosa titre d'exemple. Cette étude établit CCMS comme un outil puissant et polyvalent pour identifier biochimiquement nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une attention particulière devrait être prise à plusieurs étapes du protocole. La concentration en protéine est un paramètre critique avec une concentration de 10 mg / ml étant difficile à atteindre lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de croissance spécifiques (par exemple des biofilms ou des variants petites colonies). Ainsi, la remise en suspension du culot doit être effectuée dans un faible volume de tampon de lyse. Les concentrations de protéines peuvent être diminuées à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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