Capture Compound massespektrometri - et kraftig verktøy for å identifisere Novel c-di-GMP Effector Proteiner
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Betydelig fremskritt er blitt gjort i løpet av det siste tiåret mot identifikasjonen og karakteriseringen av enzymer som er involvert i syntesen (diguanylate cyclases) og nedbrytnings (fosfodiesterase) av den andre budbringer c-di-GMP. I kontrast, er lite informasjon tilgjengelig om de molekylære mekanismer og cellulære komponenter der dette signaliserer molekyl regulerer en rekke ulike cellulære prosesser. De fleste av de kjente effektor proteiner tilhører Pilz familie eller utartet diguanylate cyclases eller fosfodiesterase som har gitt opp på katalyse og har vedtatt effektorfunksjonen. Således, for bedre å definere den cellulære c-di-GMP-nettverk i et bredt spekter av bakterier eksperimentelle metoder er nødvendige for å identifisere og validere nye effektorer som pålitelig i silikofluorid prediksjoner mislykkes.
Vi har nylig utviklet en ny Capture forbindelse massespektrometri (CCMS) basert teknologi som et kraftig verktøy for åbiokjemisk identifisere og karakterisere c-di-GMP bindende proteiner. Denne teknikk er tidligere blitt rapportert å være anvendbar på et bredt spekter av organismer 1. Her gir vi en detaljert beskrivelse av protokollen som vi bruker for å sondere slike signalkomponenter. Som et eksempel, bruker vi Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk patogen der c-di-GMP spiller en avgjørende rolle i virulens og biofilm kontroll. CCMS identifisert 74% (38/51) av de kjente eller antatte komponenter av c-di-GMP-nettverk. Denne studien forklarer CCMS prosedyren i detalj, og etablerer det som et kraftig og allsidig verktøy for å identifisere nye komponentene som er involvert i lite molekyl signalering.
Introduction
c-di-GMP er en nøkkel andre messenger brukes av de fleste bakterier for å kontrollere ulike aspekter av deres vekst og atferd. For eksempel c-di-GMP regulerer cellesyklusprogresjon, motilitet og ekspresjon av exopolysaccharides og overflate adhesiner 2-4. Ved koordinering av slike prosesser c-di-GMP fremmer biofilmdannelse, en prosess som er assosiert med kroniske infeksjoner av en rekke patogene bakterier 5. c-di-GMP er syntetisert av enzymer som kalles diguanylate cyclases (DGCs) som havn en katalytisk GGDEF domene 4. Noen DGCs har en hemmende nettsted som ned regulerer syklaseaktivitet på c-di-GMP bindende. Nedbrytning av c-di-GMP katalyseres av to forskjellige klasser av fosfodiesterase (PDE) skjuler enten en katalytisk EAL eller HD-GYP domene 6,7.
De fleste av de kjente effektor proteiner som direkte binder c-di-GMP tilhører en av tre klasser av proteiner: katalytiskalliert inaktive GGDEF eller EAL domener og Pilz domener, små molekylære brytere som gjennomgår konformasjonsendringer ved c-di-GMP bindende 8. DGCs, PDE'er og Pilz proteiner er godt karakterisert og sine domener kan forutsies i silico relativt trygt. En spesiell interesse er nå fokusert på identifisering av nye klasser av c-di-GMP effektorer. Noen c-di-GMP effektorer med forskjellige bindingsmotiver ble beskrevet nylig eksempel CRP / FNR protein familie Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller transkripsjons regulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. I tillegg ble C-di-GMP-spesifikke riboswitches nylig identifisert og vist for å kontrollere genekspresjon i en c-di-GMP-avhengig måte 11. De c-di-GMP bindende motiver av ulike effektbokser er bare dårlig bevart lage bioinformatiske spådommer om slike proteiner vanskelig. For å løse dette problemet, har vi utviklet en biokjemisk metode, som er basert på bruk av en c-di-GMP specific Capture Compound kombinert med massespektrometri 1,12,13.
Vi har nylig utviklet en roman trivalent c-di-GMP Capture Compound (CDG-CC, figur 1) 1. Denne kjemiske Stillaset består av: 1) en c-di-GMP-del anvendes som agn for å fange opp c-di-GMP-bindende proteiner, 2) en UV-photoactivatable reaktive gruppe som brukes for å tverrbinde den CDG-CC til de bundne proteiner og 3) et biotin å isolere de fangede proteiner ved anvendelse av streptavidin-belagte magnetiske kuler. CDG-CC kan brukes til direkte og spesifikt ta c-di-GMP effektorer fra kompleks blanding av makromolekyler som cellelysater. Capture Compound basert og kjemiske proteomikk baserte tilnærminger har tidligere blitt rapportert å være knyttet til et bredt spekter av organismer, f.eks Caulobacter crescentus, Salmonella ente serovar typhimurium og P. aeruginosa 1,14.
I denne metode papir,vi gi en grundig beskrivelse av CCMS prosedyren med ekstrakter av P. aeruginosa som et eksempel. Denne studien etablerer CCMS som et kraftig og allsidig verktøy til biokjemisk identifisere nye komponentene som er involvert i lite molekyl signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spesiell forsiktighet bør utvises ved flere trinn i protokollen. Proteinkonsentrasjonen er en kritisk parameter med en konsentrasjon på 10 mg / ml er vanskelige å komme til når celler dyrkes under visse vekstbetingelser (f.eks biofilmer eller liten koloni varianter). Således bør pelleten resuspensjon utføres i et lavt volum av lyseringsbuffer. Proteinkonsentrasjonene kan reduseres til 8 mg / ml. I forhold til fremgangsmåten publisert av Nesper et al. 1, la vi forskjellige nukleotider…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
