Teknikken presenteres her måler banen fritt svømming mikroskopiske arter ved hjelp av enkelt bølgelengde eksponering. C. elegans brukes til å demonstrere skygge bildebehandling som et billig alternativ til dyre mikroskoper. Denne teknikken kan tilpasses for å imøtekomme ulike orienteringer, miljøer og arter for å måle retning, hastighet, akselerasjon og krefter.
Denne studien viser en billig og enkel teknikk som tillater måling av fysikalske egenskaper slik som posisjon, hastighet, akselerasjon og krefter som er involvert i motorisk oppførsel av nematoder suspendert i en kolonne med vann som respons på enkeltbølgelengder av lys. Vi demonstrerer hvordan man skal vurdere bevegelse av en mikroskopisk organisme ved hjelp av enkelt bølgelengde Shadow Imaging (SWSI) ved hjelp av to forskjellige eksempler.
Det første eksempel er en systematisk og statistisk bart studium av den gjennomsnittlige nedstigningen av C. elegans i en kolonne med vann. For denne studien brukte vi levende og døde villtype C. elegans. Når vi sammenlignet hastigheten og retningen på nematode aktiv bevegelse med den passive nedstigningen av døde ormer innenfor gravitasjonsfeltet, denne studien viste ingen forskjell i nedstigningen-tider. Den gjennomsnittlige nedstigningen var 1,5 mm / sek ± 0.1 mm / sek for både levende og døde ormer som bruker 633 nm sammenhengendelys.
Det andre eksemplet er en casestudie av utvalgte individuelle C. elegans endrer retning under nedstigningen i en vertikal vannsøyle. Akselerasjonen og kraft blir analysert i dette eksempel. Denne studien viser omfanget av andre fysiske egenskaper som kan evalueres ved hjelp SWSI stund vurderer atferden ved hjelp av enkle bølgelengder i et miljø som ikke er tilgjengelig med tradisjonelle mikroskoper. Ved hjelp av denne analyse beregnet vi en individuell nematode er i stand til stakk med en styrke i overkant av 28 nN.
Våre funn tyder på at levende nematoder øve 28 nN når du svinger, eller gå mot tyngdefelt. Resultatene antyder videre at nematoder passivt ned i en vannsøyle, men kan aktivt motstå tyngdekraften i første rekke ved å dreie retningen.
Caenorhabditis elegans er en frittlevende gunstig jord nematode som er en kraftig modellorganisme for å studere mekanismer for genregulering, utvikling og mer nylig for å forstå sanse biologi og adferd. Til tross for at bare 302 nevroner, C. elegans er i stand til komplekse motorisk mønstre, reproduktive atferd, navigasjon, kjemotaksis og mange andre atferd. C. elegans har mechanoreceptors, chemoreceptors og med oppdage blå bølgelengder av lys (Ward et al., 2008) 1. Mens mye er kjent om den nevrale kretser av sensorimotor funksjon og generelle motorisk mønstre i C. elegans, mindre er kjent om svar på flere, samtidige stimuli eller mer komplekse miljøforhold enn kan modelleres under et mikroskop. Noen få studier har avdekket mer komplekse motorisk mønstre som er svært plast 2,3,4. Vår metodiske tilnærming vil muliggjøre studier av nematodes i løsning i sanntid hvor vi kan lett gi flere miljøforhold samtidig. Dette spørsmålet er vanskelig å løse ved hjelp av konvensjonelle objektbaserte bildeteknikker. Vi har utviklet en avbildningsteknikk som gjør det mulig å plassere nematoder i en vannsøyle for å undersøke motorisk oppførsel, så vel som å bestemme egenskapene til nematoder for å endre bevegelse som respons på forskjellige forhold i omgivelsene.
Enkelt Wavelength Shadow Imaging (SWSI) er presentert i denne artikkelen for første gang å ta opp svakhetene i tradisjonelle mikroskoper. Tradisjonelle mikroskoper er begrenset til å observere arter i en horisontal fokusplan noen få mikrometer i dybden 5,6. Angå enkelt bølgelengde studier, de fleste tradisjonelle mikroskoper bruke fargefiltre for å filtrere hvitt lys svært bredt, vanligvis, 50-100 nm. Ved hjelp av en laser for SWSI smalner bølgelengde utvalget til mindre enn 1 nm og samtidig opprettholde tegnificant lysintensitet 7. Tilsvarende, har enkeltbølgelengder som benyttes ved måling svømme frekvenser av C. elegans i sanntid åtte.
For den første demonstrasjonen av foreliggende fremgangsmåte vi overvåke den horisontale posisjon, x, og den vertikale stilling, y, av en frittsvømmende C. elegans i en vannsøyle, over en avstand på omtrent en centimeter. Spesielt er vi interessert i den vertikale bevegelsen siden tyngdekraften fungerer også vertikalt. Skråningen av en lineær tilpasning til vertikal posisjon gir den vertikale hastighet, v y, av nematode som det går nedover i vannsøylen:
(1)
Den rotmiddelkvadrat av feilen (RMSE) 9 indikerer kvaliteten på plass og angir om den synkende hastighet er hovedsakelig konstant. De vertikale hastigheter blir deretter gjennomsnitt for EACh arter og døde ormer. Ved hjelp av disse resultatene, dra, som ormer erfaring kan anslås.
For det andre demonstrasjon av vår metode, vi valgte C. elegans som ikke stige med en konstant rate i motsetning til de fleste av ormer observert. De valgte ormer enten snudde og svømte oppover eller svevde en stund før du fortsetter nedstigningen. Fysisk, viser denne undersøkelsen at stakk av et svømmemikroorganisme kan beregnes. Newtons lover tilsier at en kropp som endrer retninger akselererer, noe som innebærer en netto kraft, , Er konstituert på at kroppen 10:
(2)
der erden bevegelsesmengde, og t er tid. Akselerasjon av snekken er direkte proporsjonal med den kraft som virker på snekke ettersom massen av snekken forblir konstant. Som et resultat, er den vertikale nettokraft:
(3)
hvor m er massen av en orm og y representerer den vertikale akselerasjon. Den nettokraft i vertikal retning utgjør da snekkeskyvekraft i samme retning. Den totale skyvekraft kan beregnes ved å ta den horisontale komponent i betraktning.
Den SWSI teknikken gir en ekstra måte å forstå motorisk evner av mikroskopiske organismer som frittlevende nematoder. Med denne teknikken har vi skilt mellom aktive locomotion (svømming) og passiv drift på grunn av tyngdekraften som opererer på døde nematoder. I tillegg, når frittsvømmende nematoder endre retning under bevegelse i vann, er vi i stand til å måle de motvirkende krefter og vinkelkrefter, som virker på nematoder, og som utøves av nematoder.
Nematoder møter ulike miljøforhold innenfor jord. Det er vann-lommer i jord, samt faste partikler og biologisk materiale av forskjellige former og teksturer. I tillegg, nematoder eksisterer innenfor et gravitasjons miljø som de svarer til 14. Videre er nematoder nær overflaten av jorden utsettes for forskjellige bølgelengder av lys, forandringer i temperatur og fuktighet, så vel som biologiskevariabler som bakterier, rov sopp og andre jordorganismer. Nematoder må svare på alle disse ulike variabler, svømming og gjennomgangen i ulike medier, snu og endre navigasjons strategier. Alle disse komplekse beregninger utføres av bare 302 neuroner, et undersett av disse er involvert i bevegelse, og 95 kroppsveggen muskelceller. Målinger av den typen beskrevet av SWSI teknikk gir viktig innsikt i hvordan nematoder oppnå dette navigasjons kompleksitet.
For den første del, har vi målt generelle synkende hastighet på villtype C. elegans i 633 nm lys. Ved hjelp av disse målingene, kan vi anslå drag kraft en orm møter.
For casestudie av en akselererende nematode, krefter involvert endring kontinuerlig siden de drag force endringer med fart. Det er noen utsagn som vi er i stand til å gjøre om de kreftene som virker på ormen. Som ormen bremser ned og prøver å swim oppover den vertikale komponenten av trekkraften avtar inntil den når null ved lave punkt av nematode bane. På dette tidspunkt må ormen har en oppadrettet kraft til å svømme opp.
Denne fremgangsmåte kan modifiseres på flere måter. Eventuelle mikroskopiske arter som navigerer i en klar væske kan spores ved hjelp SWSI. Studier kan gjennomføres med alle bølgelengder som er tilgjengelig for digitale kameraer. Digitale kameraer vil vanligvis plukke opp bølgelengder fra UV til nær IR. Dessuten kan horisontale studier gjennomføres ved å dirigere lasers vertikalt oppover. Arten kan deretter bli plassert på en horisontal gjennomsiktig underlag, som et objektglass. Justering av strålen ekspander eller forstørrelseslinse etter bjelken ekspander kan skjerpe uskarpe bilder. Brukeren skal være sikker på å feste alle komponentene til bordet for å sikre konsekvent og enkel strålejustering.
Fremgangsmåten er begrenset av tilgjengelig laser wavelengths og oppløsning. I hovedsak fordelene med denne metoden fremfor eksisterende mikroskoper, som er fleksibilitet i retninger og bølgelengder, er også svakheter siden oppsettet er enkelt. Usofistikert optikk og flekker av laseren begrense oppløsningen. Noen av disse ulempene kan sikkert bli bedre i fremtiden ved å inkludere romlig filter og projisere bildet direkte på en CCD-kamera.
De mest kritiske trinnene i protokollen kan lett lært som forsøket utføres for første gang. Plassering av nematode i kyvetten uten å skape turbulens er kritisk. Også, kan vibrasjoner forstyrre oppsettet og endre oppførselen av ormer. Vær sikker på å begrense strømmen, som blir brukt til å skyggebilde. 2 mW for en laserstråle som er 1 mm i diameter bør være maksimal for å unngå varme-effekt. Oppsettet bør testes for spredning effekter ved bruk av andre enn destillert vann væsker.
Foreløpig mest microscopes operere på en horisontalplanet ved hjelp av hvitt lys eller fargefiltre, som fortsatt er svært bred i bølgelengdeområdet. Mikroskop som virkelig bruker enkelt bølgelengder og har fleksibilitet i visnings scenario, dvs. horisontal plassering, er vanligvis begrenset til en fordel eller den andre. Også disse typer mikroskoper er vanligvis svært dyrt og fortsatt begrenset til fokusplan i motsetning til vår metode. Vårt oppsett kan lett bli bygget med et ekstremt lavt budsjett. Denne metoden er klar til å bli brukt av skoler, miljø selskaper så vel som andre enheter som opererer med liten midler. I fremtiden kan denne metoden brukes i en svært sofistikert oppsett for å studere sanntidseffekter på locomotion og mechanosensation av mikroskopiske arter. Denne metoden gjør enkelt bølgelengde studier ved et bredt spekter av vinkler og betraktningsdybde lett tilgjengelige.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for støtte fra Vassar College Graduate Research Summer Institute (Ursi), Lucy Maynard Laks forskningsfond, NASA award No NX09AU90A, National Science Foundation Center for Forskning Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) award Nei 0630388 og NSF award nr. 1058385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |