La técnica presentada aquí mide el camino de nadar libremente especies microscópicas utilizando exposición única longitud de onda. C. elegans se utilizan para demostrar sombra de formación de imágenes como una alternativa económica a los microscopios costosos. Esta técnica se puede adaptar para acomodar varias orientaciones, entornos y especies para medir la dirección, la velocidad, la aceleración y fuerzas.
Este estudio demuestra una técnica de bajo costo y sencillo que permite la medición de las propiedades físicas, tales como posición, velocidad, aceleración y fuerzas implicadas en el comportamiento locomotor de los nematodos en suspensión en una columna de agua en respuesta a longitudes de onda individuales de luz. Demostramos cómo evaluar la locomoción de un organismo microscópico usando Longitud de onda única Shadow Imaging (SWSI) utilizando dos ejemplos diferentes.
El primer ejemplo es un estudio sistemático y estadísticamente viable del descenso promedio de C. elegans en una columna de agua. Para este estudio, hemos utilizado de estar y de tipo salvaje muerto C. elegans. Cuando se comparó la velocidad y la dirección de nematodo movimiento activo con el descenso pasiva de gusanos muertos dentro del campo gravitatorio, este estudio no mostró diferencias en el descenso veces. El descenso promedio fue de 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s, tanto para los gusanos vivos y muertos utilizando 633 nm coherenteluz.
El segundo ejemplo es un estudio de caso de la selección de personal C. elegans cambiar de dirección durante el descenso en una columna vertical de agua. La aceleración y la fuerza se analizan en este ejemplo. Este estudio de caso demuestra el alcance de otras propiedades físicas que pueden ser evaluados utilizando SWSI mientras se evalúa el comportamiento utilizando longitudes de onda individuales en un ambiente que no es accesible con microscopios tradicionales. El uso de este análisis se estimó un nematodo individuo es capaz de empujar con una fuerza de más de 28 nN.
Nuestros hallazgos indican que los nematodos que viven ejercen 28 nN al girar o moverse contra el campo gravitatorio. Los resultados sugieren además que los nematodos pasivamente descienden en una columna de agua, pero pueden resistir activamente la fuerza de gravedad sobre todo por el sentido de giro.
Caenorhabditis elegans es un nematodo del suelo beneficiosos de vida libre que es un organismo modelo de gran alcance para el estudio de los mecanismos de regulación de genes, desarrollo y, más recientemente, para la comprensión de la biología sensorial y el comportamiento. A pesar de tener sólo 302 neuronas, C. elegans son capaces de complejos patrones de locomoción, los comportamientos reproductivos, la navegación, la quimiotaxis y muchos otros comportamientos. C. elegans poseen mecanorreceptores, quimiorreceptores e incluso detectar longitudes de onda de luz azul (Ward et al., 2008) 1. Aunque se sabe mucho sobre los circuitos neuronales de la función sensoriomotora y los patrones de locomoción generales en C. elegans, menos se sabe acerca de las respuestas a los múltiples estímulos simultáneos o condiciones ambientales más complejos que se pueden modelar con un microscopio. Algunos estudios han puesto de manifiesto los patrones de locomoción más complejos que son 2,3,4 muy plástico. Nuestro enfoque metodológico permitirá estudios de nematodes en solución en tiempo real en el que podemos proporcionar fácilmente múltiples condiciones ambientales simultáneamente. Esta pregunta es difícil de abordar utilizando técnicas convencionales de imagen basada en el microscopio. Hemos desarrollado una técnica que nos permite colocar los nematodos dentro de una columna de agua para examinar los comportamientos de locomoción, así como determinar las capacidades de los nematodos para cambiar la locomoción en respuesta a diferentes condiciones ambientales.
Longitud de onda única Shadow Imaging (SWSI) se presenta en este trabajo por primera vez para hacer frente a las deficiencias de los microscopios tradicionales. Microscopios tradicionales se limitan a observar especies en un plano focal horizontal unas pocas micras de profundidad 5,6. En cuanto a los estudios de longitud de onda única, la mayoría de los microscopios tradicionales utilizan filtros de color para filtrar la luz blanca de manera muy amplia, por lo general, 50 a 100 nm. El uso de un láser para SWSI se estrecha la selección de longitud de onda de menos de 1 nm, mientras que el mantenimiento de signoificant intensidad de la luz 7. Del mismo modo, las longitudes de onda individuales se han utilizado para medir las frecuencias de natación de C. elegans en tiempo real 8.
Para la primera demostración de nuestro método, monitoreamos la posición horizontal, x, y la posición vertical, y, de un C. libremente la natación elegans en una columna de agua, más de una distancia de alrededor de un centímetro. En particular, estamos interesados en el movimiento vertical ya que la gravedad también actúa verticalmente. La pendiente de un ajuste lineal a la posición vertical da la velocidad vertical, V y, del nematodo a medida que desciende en la columna de agua:
(1)
La raíz cuadrada media del error (RMSE) 9 indica la calidad del ajuste e indica si la velocidad de descenso es generalmente constante. Las velocidades verticales se promedian para eacespecies h y gusanos muertos. El uso de estos resultados, el arrastre, que la experiencia gusanos puede ser estimado.
Para la segunda demostración de nuestro método, hemos seleccionado C. elegans que no descienden a una velocidad constante a diferencia de la mayoría de los gusanos observados. Los gusanos seleccionados o bien se dieron la vuelta y nadó hacia arriba o hacia rondaban por un tiempo antes de continuar el descenso. Físicamente, este estudio de caso muestra que la idea central de un microorganismo de natación se puede calcular. Las leyes de Newton dictan que un cuerpo que cambia de dirección se acelera, lo que implica una fuerza neta, , Es que actúa sobre ese cuerpo 10:
(2)
donde esla cantidad de movimiento y t es el tiempo. La aceleración del gusano es directamente proporcional a la fuerza que actúa sobre el gusano ya que la masa del gusano permanece constante. Como resultado, la fuerza neta vertical es:
(3)
donde m es la masa de un tornillo sin fin y una de las y representa la aceleración vertical. La fuerza neta en la dirección vertical representa la fuerza de propulsión gusano en la misma dirección. El empuje total se puede calcular tomando la componente horizontal en cuenta.
La técnica SWSI proporciona un medio adicional para entender las capacidades de locomoción de organismos microscópicos como los nematodos de vida libre. Con esta técnica se ha distinguido entre la locomoción activa (natación) y la deriva pasiva debido a la gravedad que opera sobre los nematodos muertas. Además, cuando nadan libremente nemátodos cambian de dirección durante la locomoción en el agua, que son capaces de medir las fuerzas de arrastre y las fuerzas angulares, que están operando en los nematodos y ejercida por los nematodos.
Los nematodos se encuentran con diferentes condiciones ambientales dentro del suelo. Hay bolsas de agua dentro del suelo, así como partículas sólidas y materiales biológicos de diferentes formas y texturas. Además, existen nematodos dentro de un entorno gravitacional que responden a 14. Además, los nematodos cerca de la superficie del suelo están expuestos a diferentes longitudes de onda de la luz, cambios en la temperatura y la humedad, así como biológicavariables como bacterias, hongos depredadores y otros organismos del suelo. Los nematodos deben responder a todas estas diferentes variables, nadando y arrastrándose en diferentes medios de comunicación, el torneado y la alteración de las estrategias de navegación. Todos estos cálculos complejos se llevan a cabo por sólo 302 neuronas, un subconjunto de los cuales están implicados en la locomoción, y 95 células musculares de la pared del cuerpo. Las mediciones del tipo descrito por la técnica SWSI proporcionan información importante sobre cómo nematodos lograr esta complejidad de navegación.
Para la primera parte, hemos medido la tasa de descenso general de tipo salvaje C. elegans en 633 nm de luz. El uso de estas mediciones, se puede estimar la fuerza de arrastre a los encuentros de gusano.
Para el estudio de caso de un nematodo de aceleración, las fuerzas involucradas cambio continuamente desde la fuerza de resistencia cambia con la velocidad. Hay algunas afirmaciones que podemos hacer acerca de las fuerzas que actúan sobre el gusano. A medida que el gusano se ralentiza y trata de swim hacia arriba la componente vertical de la fuerza de arrastre disminuye hasta llegar a cero en el punto más bajo de la trayectoria del nematodo. En este punto, el gusano debe tener una fuerza hacia arriba para nadar.
Este método se puede modificar de varias maneras. Cualquier especie microscópicos que navega en un líquido claro se pueden seguir usando SWSI. Los estudios pueden llevarse a cabo con cualquier longitudes de onda que son accesibles a las cámaras digitales. Las cámaras digitales suelen recogerá longitudes de onda que van de la UV a IR cercano. Además, los estudios horizontales pueden llevarse a cabo dirigiendo el láser verticalmente hacia arriba. La especie puede entonces ser colocado en una superficie transparente horizontal, como un portaobjetos de microscopio. Ajuste del expansor de haz o el lente de aumento después de la expansión del haz puede agudizar las imágenes borrosas. El usuario debe asegurarse de ajustar todos los componentes de la mesa para asegurar la alineación de haz coherente y fácil.
El método está limitada por wavelengt láser disponibleshs y resolución. En esencia, las ventajas de este método más de microscopios existentes, que son la flexibilidad en direcciones y longitudes de onda, son también puntos débiles desde la configuración es simple. La óptica poco sofisticados y motas del láser limitan la resolución. Algunos de estos inconvenientes, sin duda se puede mejorar en el futuro mediante la inclusión de filtro espacial y la proyección de la imagen directamente en una cámara CCD.
Los pasos más críticos en el protocolo pueden ser fácilmente extraídas como se realiza el experimento por primera vez. La colocación del nematodo en la cubeta sin crear turbulencia es crítico. Además, las vibraciones pueden perturbar la configuración y alterar el comportamiento de los gusanos. Asegúrese de limitar el poder, que se utiliza a la sombra de la imagen. 2 mW para un rayo láser que es 1 mm de diámetro debe ser el máximo para evitar efectos de calentamiento. La configuración debe ser probado para la dispersión efectos al usar líquidos distintos del agua destilada.
Actualmente la mayor parte microscopes operan en un plano horizontal con luz blanca o de color filtros, que siguen siendo muy amplio en la gama de longitud de onda. Microscopios que realmente utilizar longitudes de onda individuales y tener flexibilidad en el escenario de la visión, es decir, la colocación horizontal, por lo general se limitan a una ventaja o la otra. Además, este tipo de microscopios suelen ser muy caros y todavía limitado a planos focales a diferencia de nuestro método. Nuestra configuración puede ser fácilmente construido con un presupuesto muy bajo. Este método está listo para ser utilizado por las escuelas, las empresas ambientales, así como otras entidades que operan con pocos fondos. En el futuro, este método se puede utilizar en una configuración muy sofisticado para estudiar los efectos en tiempo real sobre la locomoción y mechanosensation de especies microscópicas. Este método hace que los estudios de longitud de onda única en una amplia gama de ángulos y profundidades de visión fácilmente disponibles.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos por el apoyo del Instituto de Investigación de Pregrado Vassar College Summer (URSI), el Fondo de Investigación Salmon Lucy Maynard, premio NASA No. NX09AU90A, Fundación Nacional de Ciencias Centro de Excelencia de Investigación en Ciencia y Tecnología (NSF-CREST) laudo No 0630388 y la NSF laudo No 1.058.385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |