Tekniken presenteras här mäter banan av fritt simmar mikroskopiska arter med hjälp av en enda våglängd exponering. C. elegans används för att demonstrera skugga avbildning som ett billigt alternativ till dyra mikroskop. Denna teknik kan anpassas till olika riktlinjer, miljöer och arter för att mäta riktning, hastighet, acceleration och krafter.
Denna studie visar en billig och okomplicerad teknik som tillåter mätning av fysikaliska egenskaper, såsom läge, hastighet, acceleration och krafter som är involverade i motoriskt beteende hos nematoder som är suspenderade i en vattenpelare som svar på enkla ljusvåglängder. Vi visar hur man ska utvärdera förflyttning av en mikroskopisk organism med hjälp En våglängd Shadow Imaging (SWSI) med hjälp av två olika exempel.
Det första exemplet är en systematisk och statist livskraftig undersökning av den genomsnittliga nedstigande C. elegans i en vattenpelare. För denna studie använde vi levande och döda vildtyp C. elegans. När vi jämförde hastigheten och riktningen av nematod aktiv rörelse med den passiva härkomst av döda maskar i gravitationsfältet, visade studien ingen skillnad i härkomst-tider. Den genomsnittliga härkomst var 1,5 mm / s ± 0,1 mm / sek för både levande och döda maskar som använder 633 nm sammanhängandeljus.
Det andra exemplet är en fallstudie av välja enskilda C. elegans ändrar riktning under nedstigningen i en vertikal vattenpelare. Acceleration och kraft analyseras i detta exempel. Denna fallstudie visar omfattningen av andra fysikaliska egenskaper som kan utvärderas med hjälp av SWSI samtidigt utvärdera beteendet med hjälp av enskilda våglängder i en miljö som inte är tillgänglig med traditionella mikroskop. Med hjälp av denna analys som vi uppskattat en individuell nematod kan stack med en kraft på över 28 nN.
Våra resultat tyder på att levande nematoder utövar 28 nN när du svänger, eller rör sig mot gravitationsfältet. Resultaten tyder vidare att nematoder passivt ner i en vattenpelare, men kan aktivt motstå gravitationen i första hand genom att vrida riktningen.
Caenorhabditis elegans är en fritt levande välgörande jord nematod som är ett kraftfullt modellorganism för att studera mekanismer för genreglering, utveckling och på senare tid för att förstå sensorisk biologi och beteende. Trots att bara 302 nervceller, C. elegans klarar av komplexa motoriskt mönster, fortplantningsbeteenden, navigation, kemotaxi och många andra beteenden. C. elegans besitter mekanoreceptorer, chemoreceptors och även upptäcka blå våglängder av ljus (Ward et al., 2008) 1. Även om mycket är känt om de neurala kretsar av sensomotorisk funktion och allmänna motoriskt mönster i C. elegans, mindre är känt om svaren på multipla, samtidiga stimuli eller mer komplexa miljöförhållanden än vad som kan modelleras i mikroskop. Några studier har visat mer komplexa motoriskt mönster som är mycket plast 2,3,4. Vår metodologi möjliggör studier av nematodes i lösning i realtid där vi lätt kan ge flera miljöförhållanden samtidigt. Denna fråga är svår att behandla med konventionella mikroskop baserade avbildningstekniker. Vi har utvecklat en bildteknik som gör att vi kan placera nematoder i en vattenpelare för att undersöka motoriskt beteende, samt fastställa möjligheterna för nematoder ändra förflyttning som svar på olika miljöförhållanden.
En våglängd Shadow Imaging (SWSI) presenteras i denna rapport för första gången att ta itu med bristerna i traditionella mikroskop. Traditionella mikroskop är begränsade att observera arter i ett horisontellt fokalplan några mikrometer i djup 5,6. När det gäller enstaka våglängd studier, de flesta traditionella mikroskop använder färgfilter för att filtrera vitt ljus väldigt brett, oftast, 50-100 nm. Med användning av en laser för SWSI smalnar våglängdsselektering till mindre än 1 nm under bibehållande teckenificant ljusintensitet 7. På liknande sätt har enstaka våglängder använts för att mäta simning frekvenser av C. elegans i realtid 8.
För det första demonstration av vår metod, övervakar vi horisontellt läge, x, och den vertikala positionen, y, av ett fritt simmar C. elegans i en vattenpelare, över ett avstånd på cirka en centimeter. Framför allt är vi intresserade av den vertikala rörelsen eftersom gravitationen fungerar även vertikalt. Lutningen av en linjär anpassning till det vertikala läge som ger den vertikala hastigheten, v y, av nematoden som går ner i vattnet:
(1)
Det kvadratiska medelvärdet av felet (RMSE) 9 indikerar kvaliteten på passform och anger om den fallande hastigheten är i allmänhet konstant. De vertikala hastigheter då medelvärdet för each arter och döda maskar. Med hjälp av dessa resultat, drag, som maskar erfarenhet kan uppskattas.
För det andra demonstration av vår metod, valde vi C. elegans som inte stiger ned med en konstant hastighet till skillnad från de flesta av maskar som observerats. De valda maskar antingen vände och simmade uppåt eller svävade ett tag innan du fortsätter nedstigningen. Fysiskt, visar denna studie att syftet med en swimming mikroorganism kan beräknas. Newtons lagar föreskriver att en kropp som ändrar riktningar accelererar, vilket innebär en nettokraft, , Är att agera på kroppen 10:
(2)
där ärden linjära drivkraften och t är tid. Accelerationen av masken är direkt proportionell mot den kraft som verkar på snäck eftersom massan av masken förblir konstant. Som ett resultat, är den vertikala nettokraften:
(3)
där m är massan av en mask och en y representerar den vertikala accelerationen. Den nettokraft i vertikal riktning representerar då masken dragkraft i samma riktning. Den totala dragkraften kan beräknas med hjälp av den horisontella komponenten i beaktande.
Den SWSI tekniken ger ytterligare ett sätt att förstå de motoriskt kapacitet mikroskopiska organismer som fritt levande nematoder. Med denna teknik har vi skiljer mellan aktiv rörelseförmåga (simning) och passiv drift på grund av tyngdkraften verkar på döda nematoder. Dessutom, när frisimmande nematoder ändra riktning under förflyttning i vatten, har vi möjlighet att mäta dragkrafter och vinkelkrafter, vilka är verksamma på nematoder och utövas av nematoder.
Nematoder möter olika miljöförhållanden i marken. Det finns vattenfickor inom jord, såväl som fasta partiklar och biologiska material i olika former och texturer. Dessutom finns nematoder i ett gravitations miljö som de svarar på 14. Vidare är nematoder nära ytan av jorden utsätts för olika våglängder av ljus, förändringar i temperatur och fuktighet, såväl som biologisktvariabler som bakterier, underprissättning svampar och andra marklevande organismer. Nematoder måste svara på alla dessa olika variabler, simning och krypa i olika medier, vrida och ändra navigerings strategier. Alla dessa komplexa beräkningar utförs av endast 302 nervceller, en delmängd av dessa är involverade i förflyttning och 95 kroppsväggen muskelceller. Mätningar av det slag som beskrivs av SWSI teknik ger viktig inblick i hur nematoder åstadkomma detta navigations komplexitet.
För den första delen, har vi mätt den totala fallande takt vildtyp C. elegans i 633 nm ljus. Med hjälp av dessa mätningar kan vi uppskatta dragkraft en mask möten.
För fallstudie av en accelererande nematod, de krafter inblandade förändring kontinuerligt sedan dragkraft ändras med hastigheten. Det finns vissa uttalanden som vi har möjlighet att göra om de krafter som verkar på masken. Eftersom snäck saktar ner och försöker swim uppåt den vertikala komponenten av dragkraften minskar tills den når noll vid den lägsta punkten av nematoden bana. Vid denna punkt, måste masken ha en uppåtriktad kraft att simma upp.
Detta förfarande kan modifieras på flera sätt. Eventuella mikroskopiska arter som navigerar i en klar vätska kan spåras med hjälp SWSI. Studier kan genomföras med alla våglängder som är tillgängliga för digitalkameror. Digitalkameror normalt plocka upp våglängder som sträcker sig från UV till nära IR. Dessutom kan horisontella studier utföras genom att rikta laser vertikalt uppåt. Arten kan sedan placeras på ett horisontellt transparent yta, som ett mikroskopobjektglas. Justera strålexpanderaren eller förstoringsglas efter strålexpanderaren kan vässa suddiga bilder. Användaren ska se till att fästa alla komponenter till bordet för konsekvent och lätt ljushöjden.
Metoden begränsas av tillgänglig laser wavelengths och upplösning. I huvudsak fördelarna med denna metod jämfört med existerande mikroskop, som är den flexibilitet i riktningar och våglängder, är det också brister eftersom installationen är enkel. De osofistikerade optik och prickar av lasern begränsar upplösningen. En del av dessa nackdelar kan säkert förbättras i framtiden genom att inkludera rumslig filter och projicerar bilden direkt på en CCD-kamera.
De mest kritiska stegen i protokollet kan enkelt lärt sig som experimentet utförs för första gången. Placering nematoden i kyvetten utan att skapa turbulens är kritisk. Dessutom kan vibrationer störa installationen och förändra beteendet hos maskarna. Var noga med att begränsa den effekt, som används för att skugga bilden. 2 mW för en laserstråle som är 1 mm i diameter bör vara maximalt för att undvika värmeeffekter. Installationen bör testas för spridning effekter vid användning av andra än destillerat vatten vätskor.
För närvarande de flesta microscopes verka på ett horisontellt plan med hjälp av vitt ljus eller färgfilter, som fortfarande är mycket bred i våglängdsområdet. Mikroskop som verkligen använder enstaka våglängder och har flexibilitet i visnings scenariot, dvs horisontell placering, är vanligtvis begränsad till en fördel eller det andra. Även dessa typer av mikroskop är oftast mycket dyra och fortfarande begränsad till fokalplan skillnad från vår metod. Vår inställning kan enkelt byggas med en extremt låg budget. Denna metod är redo att användas av skolor, miljö företag samt andra organ som arbetar med små medel. I framtiden kan denna metod användas på ett mycket sofistikerat setup för att studera realtidseffekter på rörelseförmåga och mechanosensation av mikroskopiska arter. Denna metod gör enstaka våglängd studier på en rad olika vinklar och visningsdjup lätt tillgängliga.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för stödet från Vassar College Grundutbildning Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund, NASA utmärkelse nr NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence inom vetenskap och teknik (NSF-CREST) utmärkelse nr 0630388 och NSF utmärkelsen nr 1.058.385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |