में मेटाबोलाइट्स के जांच के लिए MALDI-बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग<em> Medicago truncatula</em> जड़ पिंड
Summary
बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग (एमएसआई) जैविक प्रक्रियाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो अपने मूल वातावरण में यौगिकों के संरक्षण बरकरार ऊतकों में विभिन्न रासायनिक प्रजातियों की खोज और पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. इस के साथ साथ छोटे अणुओं के विश्लेषण के लिए विकसित की एक MSI विधि वर्णित है.
Abstract
, ऐसी दवाइयों या अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के रूप में छोटे अणुओं का अध्ययन संभवतः 1 अध्ययन किया जा रहा चयापचय मार्ग में परिवर्तन का कारण बन सकता है कि ब्याज की ऊतक के homogenization की आवश्यकता होती है जो ऊतकों के अर्क को रोजगार के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल तकनीक. बड़े पैमाने पर spectrometric इमेजिंग (एमएसआई) जैविक ऊतक के नमूने 1-5 बरकरार स्लाइस भीतर analytes की स्थानिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है. इस तकनीक को प्रोटीन, पेप्टाइड, लिपिड, और इस तरह के अंतर्जात मेटाबोलाइट्स के रूप में छोटे अणुओं सहित यौगिकों के विभिन्न प्रकार के अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) MSI, कई मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण एक साथ पाया जा सकता है. इस के साथ साथ, फली जड़ों और जड़ पिंड पर अलक्षित metabolomics MSI प्रयोगों के संचालन के लिए विशेष रूप से विकसित एक विधि जगह लेने जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि बता सकता है जो प्रस्तुत किया है.विधि यहाँ प्रस्तुत नमूना तैयार करने से छवि अधिग्रहण करने के लिए, एक ठेठ MSI कार्यप्रवाह से पता चलता है, और छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए उपयोगी होते हैं कि कई मैट्रिक्स आवेदन तकनीकों का प्रदर्शन, मैट्रिक्स आवेदन कदम पर केंद्रित है. एमएस छवियों को उत्पन्न कर रहे हैं, ब्याज की मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण और पहचान पर चर्चा की और प्रदर्शन किया है. यहाँ प्रस्तुत मानक कार्यप्रवाह आसानी से विभिन्न प्रकार के ऊतकों, आणविक प्रजातियों, और इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
metabolomics के बढ़ते क्षेत्र biomarker खोज, पौधों और अन्य जैविक प्रणालियों में चयापचय मार्ग का गूढ़ रहस्य, और विष विज्ञान रूपरेखा 4,6-10 सहित कई महत्वपूर्ण जैविक आवेदन किया है. जैविक प्रणालियों का अध्ययन करते समय एक प्रमुख तकनीकी चुनौती उन्हें 11 में खलल न डालें बिना metabolomic रास्ते का अध्ययन करना है. MALDI-MSI एकल अंगों 12,13 और भी एकल कक्षों 14,15 में analytes की संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है बरकरार ऊतकों के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
नमूना तैयार करने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय जन वर्णक्रमीय छवियों के निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम है. छवियों की गुणवत्ता में काफी ऐसे ऊतक एम्बेडिंग मध्यम, टुकड़ा मोटाई, MALDI मैट्रिक्स, और मैट्रिक्स आवेदन तकनीक जैसे कारकों पर निर्भर करता है. इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, आदर्श अनुभाग मोटाई एक सेल (नमूना प्रकार के आधार पर 8-20 माइक्रोन) की चौड़ाई है. MALDI एक कार्बनिक, crystallin के बयान की आवश्यकताई मैट्रिक्स परिसर, analyte पृथक और आयनीकरण की सहायता के लिए नमूना पर आम तौर पर एक कमजोर एसिड,. 16 विभिन्न matrices अलग संकेत तीव्रता, दखल आयनों, और यौगिकों के विभिन्न वर्गों के आयनीकरण क्षमता प्रदान करते हैं.
मैट्रिक्स आवेदन तकनीक भी जन वर्णक्रमीय छवियों और विभिन्न तकनीकों की गुणवत्ता में एक भूमिका analytes की विभिन्न कक्षाओं के लिए उपयुक्त हैं निभाता है. तीन मैट्रिक्स आवेदन तरीकों इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं: airbrush, स्वचालित स्प्रेयर, और उच्च बनाने की क्रिया. एयरब्रश मैट्रिक्स आवेदन व्यापक रूप से MALDI इमेजिंग में इस्तेमाल किया गया है. airbrush मैट्रिक्स आवेदन का लाभ यह अपेक्षाकृत तेज और आसान है. हालांकि, airbrush मैट्रिक्स आवेदन की गुणवत्ता बहुत उपयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर करता है और कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना और analytes की प्रसार, विशेष रूप से छोटे अणुओं 17 पैदा करता है. स्वचालित स्प्रेयर सिस्टम मैट्रिक्स आवेदन airbrush के समान यांत्रिकी है, लेकिन हवलदारई स्प्रे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने, पुस्तिका airbrush आवेदन के साथ देखा परिवर्तनशीलता को दूर करने के लिए विकसित किया गया. इस विधि कभी कभी अधिक समय लेने वाली पारंपरिक airbrush मैट्रिक्स आवेदन की तुलना में किया जा सकता है. पुस्तिका airbrush और स्वचालित स्प्रेयर सिस्टम दोनों विलायक आधारित मैट्रिक्स आवेदन तरीके हैं. हालांकि, इसे निकालने और उच्च द्रव्यमान यौगिकों 18 निरीक्षण करने के लिए विलायक आवश्यक अभाव है, उच्च बनाने की क्रिया यह analyte प्रसार को कम कर देता है क्योंकि मेटाबोलाइट्स और छोटे अणुओं की जन वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है कि एक सूखी मैट्रिक्स आवेदन तकनीक है.
मेटाबोलाइट्स की आत्मविश्वास से लबरेज पहचान आम तौर पर मिलकर जन एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा मानकों, साहित्य, या सैद्धांतिक स्पेक्ट्रा की तुलना में किया जा रहा है साथ मान्यता के लिए (एमएस / एमएस) प्रयोगों द्वारा पीछा ख्यात पहचान प्राप्त करने के लिए जन सटीक माप की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प में (जन एम / Z 400 पर 60,000 की शक्ति को हल), तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) एमएस Medicago जैविक प्रणाली के रूप में जड़ों और जड़ पिंड truncatula का उपयोग, स्थानिक जानकारी और अंतर्जात मेटाबोलाइट्स का पूरा भरोसा पहचान दोनों प्राप्त करने के लिए MALDI-एमएसआई के लिए युग्मित है. एमएस / एमएस प्रयोगों MALDI-एमएसआई के साथ या नियंत्रण रेखा एमएस के साथ ऊतक निष्कर्षों पर ऊतक पर सीधे प्रदर्शन किया और metabolite पहचान के सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल एम. में अंतर्जात मेटाबोलाइट्स नक्शा करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है अनुकूलित और विभिन्न प्रकार के ऊतकों और जैविक प्रणालियों में छोटे अणुओं का एमएसआई के लिए लागू किया जा सकता है जो truncatula,.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर चर्चा की, नमूना तैयार करने MSI कार्यप्रवाह में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. असमान रूप से ऊतक एम्बेड कुछ मामलों में संभव मुश्किल या नहीं होने की सेक्शनिंग कारण होगा. खंड आकार और पर्याप्त संतुलन समय ऊतक अखं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Medicago truncatula नमूने उपलब्ध कराने के लिए UW-Madison में कृषि विज्ञान विभाग में डॉ. ज्यां मिशेल ane स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था अनुदान चे 0957784, विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के ग्रेजुएट स्कूल और विस्कॉन्सिन पूर्व छात्रों रिसर्च फाउंडेशन (WARF) और ROMNES फैकल्टी रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम (करूँगा के लिए). ईजी एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-1256259) मानता है.
Materials
| Gelatin | Difco | 214340 | heat to dissolve |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Scientific | 956564A | |
| indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25-75-0.8 mm (width-length-thickness) |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | ICN Biomedicals | PI90033 | |
| Airbrush | Paasche Airbrush Company | TG-100D | coupled with 75 ml steel container |
| Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer | HTX Technologies, LLC | HTX.TMSP.H021-U | Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed |
| Sublimation apparatus | Chemglass Life Science | CG-3038-01 | |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | Ultimate Pressure = 1×10-4 Torr |
| ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | 276601 | |
| FlexImaging | Bruker Daltonics | 269841 | One example of "vender specific software" |
| MALDI LTQ Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMASZ | High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements |
| Q Exactive | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements |
References
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