Выделение малых некодирующих РНК из сыворотки крови человека

Summary

Этот протокол описан способ извлечения малые РНК из сыворотки крови человека. Мы использовали этот метод, чтобы изолировать микроРНК от рака сыворотки для использования в массивах ДНК, а также однокомпонентных количественной ПЦР. Протокол использует фенола и гуанидиния тиоцианат реагенты с изменениями, и получают высокое качество РНК.

Abstract

Анализ РНК и ее выражения является общей чертой во многих лабораториях. Важное значение имеет появление малых РНК, как микроРНК, которые находятся в клетках млекопитающих. Эти малые РНК являются мощными регуляторами ген, контролирующий жизненные пути, такие как рост, развитие и смерть и большим интересом была направлена ​​на их выражения в жидкостях организма. Это связано с их регуляции в человеческих заболеваний, таких как рак и их потенциального применения в качестве сыворотки биомаркеров. Тем не менее, анализ микроРНК выражения в сыворотке может быть проблематичным. В большинстве случаев количество сыворотки ограничения и сыворотка содержит небольшое количество общей РНК, из которых малые РНК составляют лишь 0,4-0,5% ^1. Таким образом, изоляция достаточного количества качественного РНК из сыворотки является основной проблемой для исследователей сегодня. В этом техническом документе, мы демонстрируем метод, который использует только 400 мкл сыворотки крови человека, чтобы получить достаточную РНК или для массивов ДНК или анализа КПЦР.dvantages этого метода являются его простота и способность приносить высокое качество РНК. Она не требует специализированных колонки для очистки малых РНК и использует общие реагенты и оборудование, найденные в общих лабораториях. Наша методика использует блокировки гель фазу для устранения загрязнения фенола в то же время получают высокое качество РНК. Мы также ввести дополнительный шаг для дальнейшего удаления все загрязнения во время стадии выделения. Этот протокол является очень эффективным при выделении выходы общей РНК до 100 нг / мкл из сыворотки, но также могут быть адаптированы для других биологических тканей.

Introduction

В последние годы наблюдается растущий нажим для того чтобы обнаружить новые биомаркеры для раннего выявления заболеваний человека. Большое внимание было сосредоточено на использовании малых РНК, такие как микроРНК ² (микроРНК или Мирс) в качестве потенциальных маркеров. Эти малые РНК находятся в жидкостях организма, таких как сыворотка и исследования показали, что они устойчивы к деградации и стабильны в широком диапазоне различных условий окружающей среды ^3. Учитывая эти особенности, сыворотки или циркулирующие микроРНК являются идеальным биомаркеров ^{4, 5.} В настоящее время существует два основных подхода к выделению малых РНК из биологических жидкостей. Первый подход использует технологию столбца на основе связывать и вымывания малые РНК ^6, в то время как второй подход использует давние протокол с фенолом и гуанидиния тиоцианатных реагентов ^7. Мы разработали простой и эффективный, колонка без протокола, чтобы изолировать малые РНК из сыворотки крови человека. Выделенный РНК немедленноленно использовать в последующих применений, в том числе олигонуклеотидных ДНК массивов и РНК последовательности.

Этот протокол был разработан, потому что мы столкнулись с несколькими вопросами при использовании на основе фенола методы, чтобы изолировать РНК из сыворотки. Традиционный подход Chomczynski часто используется в большинстве лабораторий с диапазоном реагентов, доступных на большинстве коммерческих поставщиков. Однако, учитывая их широкое применение, строгие правила не были разработаны, чтобы постоянно производить высококачественный РНК из жидкостей организма, в частности, крови или сыворотке.

Общие проблемы, связанные с выделения РНК из сыворотки включают низкие урожаи РНК и загрязнения с реагентов, используемых в процессе выделения, в частности фенола. Наш подход устраняет эти фенольные загрязнений обеспечить высокое качество РНК для последующей анализа, таких как количественной ПЦР (КПЦР) и РНК последовательности. Далее мы тестировалась РНК на массивах микроРНК.

Protocol

Примечание: образцы сыворотки крови человека от здоровых пациентов или пациентов с раком были получены с информированного согласия при утвержденных этических протоколов человека от Королевского больница Принца Альфреда Сиднее (протокол номер X10-0016 и HREC/10/RPAH/24) и Технологическом униве…

Representative Results

Рисунок 1 представляет собой типичный UV / VIS спектр РНК, выделенной из сыворотки. Из этого профиля уже отмечалось загрязнения белка при 280 нм с фенолом и органических загрязнений и при 270 нм и 230 нм, соответственно. Остаток гуанидиния Тиоцианат Было также отмечено, при 260 нм. Для ум?…

Discussion

Популяция микроРНК составляет примерно 0,4-0,5% от общей РНК, найденного в сыворотке крови. Кроме того есть также высокое содержание белка, обнаруженного в сыворотке крови человека. Для улучшения РНК и снизить как белок и фенола загрязняет мы изменили традиционный подход Chomczynski ⁹ с д?…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–