Isolering av små icke-kodande RNA från humant serum

Summary

Detta protokoll beskriver ett förfarande för extraktion av små RNA från humant serum. Vi har använt denna metod för att isolera microRNAs från cancer serum för användning i DNA-matriser och även singleplex kvantitativ PCR. Protokollet använder fenol och guanidinium thiocyanate reagenser med ändringar ger hög kvalitet RNA.

Abstract

Analys av RNA och dess uttryck är ett gemensamt drag i många laboratorier. Av betydelse är framväxten av små RNA som mikroRNA, som finns i däggdjursceller. Dessa små RNA är potenta genregulatorer kontrollerar viktiga vägar som tillväxt, utveckling och död och mycket intresse har riktats mot deras uttryck i kroppsvätskor. Detta beror på deras dysregulation i mänskliga sjukdomar som cancer och deras potentiella användning som serumbiomarkers. Emellertid kan analysen av miRNA uttryck i serum vara problematisk. I de flesta fall den mängd serum är begränsande och serum innehåller låga mängder av total-RNA, av vilka små RNA utgör endast 0,4 till 0,5% ^1. Isolering av tillräckliga mängder av kvalitet RNA från serum är alltså en stor utmaning för forskare i dag. I denna tekniska papper, visar vi en metod som använder endast 400 l av humant serum för att erhålla tillräckligt RNA för antingen DNA-arrayer eller qPCR analys. I endvantages med denna metod är dess enkelhet och förmåga att ge högkvalitativt RNA. Det kräver inga speciella kolumner för rening av små RNA och använder allmänna reagenser och hårdvara som finns i vanliga laboratorier. Vår metod använder en faslåst Gel för att eliminera kontamine fenol medan på samma gång, vilket gav hög kvalitet RNA. Vi introducerar också ett ytterligare steg för att ytterligare ta bort alla föroreningar under isoleringssteget. Detta protokoll är mycket effektiv i att isolera utbytena av total-RNA på upp till 100 ng / ul från serum, men kan också anpassas för andra biologiska vävnader.

Introduction

Under de senaste åren har det funnits ett växande tryck att upptäcka nya biomarkörer för tidig upptäckt av humana sjukdomar. Mycket uppmärksamhet har fokuserat på att använda små RNA såsom mikroRNA ² (miRNA eller miRs) som potentiella markörer. Dessa små RNA återfinns i kroppsvätskor såsom serum och studier har visat att de är motståndskraftiga mot nedbrytning och är stabila över ett intervall av varierande miljövillkor ^3. Med tanke på dessa funktioner, serum eller cirkulerande miRNA är den idealiska biomarkörer ^{4, 5.} För närvarande finns det två huvudsakliga metoder för isolering av små RNA från biologiska vätskor. Den första metoden använder kolumnbaserad teknik för att binda och eluera små RNA ^6, medan den andra metoden använder långvariga protokoll med fenol och guanidinium thiocyanate reagenser ^7. Vi har utvecklat en enkel, effektiv, kolumn fritt protokoll för att isolera små RNA från humant serum. Det isolerade RNA är omedelbartbart kan användas i tillämpningar i senare led, bland annat DNA-oligonukleotid arrayer och RNA-sekvensering.

Detta protokoll har utvecklats för att vi konfronterades med flera problem vid användning av fenolbaserade metoder för att isolera RNA från serum. Den traditionella Chomczynski metod används ofta i de flesta laboratorier med en rad olika reagenser tillgängliga från de flesta kommersiella leverantörer. Men med tanke på deras omfattande användning, stränga riktlinjer har inte utvecklats för att konsekvent producera högkvalitativa RNA från kroppsvätskor, framför allt blod eller serum.

Vanliga problem i samband med att isolera RNA från serum inkluderar låga RNA avkastning och förorening med reagenser som används vid isolering, speciellt fenol. Vårt tillvägagångssätt eliminerar dessa fenolföroreningar för att ge hög kvalitet RNA för efterföljande analys såsom kvantitativ PCR (qPCR) och RNA-sekvensering. Vi har dessutom testat detta RNA på miRNA matriser.

Protocol

OBS: Human serumprover från friska patienter eller patienter med cancer erhölls med informerat samtycke enligt godkända humana etiska protokoll från Royal Prince Alfred Hospital Sydney (Protokoll nummer X10-0016 och HREC/10/RPAH/24) och University of Technology, Sydney. Serumprover samlades in från patienter före operation från olika Sydney sjukhus och placeras i lager vid -80 ° C. 1. Små RNA Isolering från Serum Totalt RNA framställdes från humanserum …

Representative Results

Figur 1 representerar en typisk UV / Vis-spektrum för RNA isolerat från serum. Från den här profilen noterade vi kontamine protein vid 280 nm med fenol och organiska föroreningar både vid 270 nm och 230 nm, respektive. Återstod guanidiniumtiocyanat noterades också vid 260 nm. För att minska föroreningar, var en serie optimeringssteg som görs av standard Tri-reagens RT-LS förfarande. Vi lagt till 5 mg / ml glykogen för att öka både den totala RNA avkastningen och minska föroreningar (svar…

Discussion

Populationen av microRNAs utgör cirka 0,4-0,5% av den totala RNA som finns i serum. Vidare finns det också en hög proteinhalt som finns i humant serum. För att förbättra RNA och minska både protein och fenol förorenar vi har modifierat den traditionella Chomczynski tillvägagångssätt ⁹ med tillägg av flera steg.

Total RNA isolerades från serum med hjälp av standard Tri-reagens RT-LS (Molecular Research Centre) men när de utförs i vårt laboratorium, denna metod gav …

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description (optional)
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Centre, USA	TR 118	–
RNase free H20	GIBCO Invitrogen	10977-023	–
Proteinase K	Finnzymes, Finland	EO0491	–
Heavy Phaselock Tube	5PRIME	2302830	2ml capacity
DNA Lobind tube	Eppendorf	0030 108.078	1.5ml capacity
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5mg/ml
RNA grade Isopropanol	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Refrigerated Centrifuge	John Morris	–	–
Nanodrop UV-Vis spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA	–	–
RNA grade Ethanol	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Agilent 2100 Bioanalyser	Agilent, USA	–	–