تعبير مغايرة وتنقية التليف الكيسي عبر الغشاء تصرف منظم (CFTR) هي تحديات كبيرة والعوامل التي تحول دون تطوير علاجات المخدرات للكشف عن التليف الكيسي. يصف هذا البروتوكول طريقتين لعزل كميات مليغرام من CFTR مناسبة للدراسات الفنية والهيكلية.
عيوب في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) البروتين يسبب التليف الكيسي (CF)، وهو مرض وراثي جسمي مقهور التي تحد حاليا متوسط العمر المتوقع للمرضى إلى <40 سنة من العمر. تطوير جزيئات المخدرات رواية لاستعادة النشاط من CFTR هو هدف مهم في CF العلاج، وعزل CFTR نشطة وظيفيا هو خطوة مفيدة نحو تحقيق هذا الهدف.
نحن تصف طريقتين لتنقية CFTR من نظام تعبير مغايرة حقيقية النواة، S. الخباز. مثل أنظمة بدائية النواة، S. خميرة يمكن زراعتها في المختبر بسرعة وبتكلفة منخفضة، ولكن أيضا حركة المرور وposttranslationally يمكن تعديل البروتينات الغشاء كبيرة. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا رئيسينntrasting المنظفات لاستخدامها في تنقية تسمح إعداد CFTR النهائي ليكون متلائما مع التجارب المخطط لها في وقت لاحق.
في هذه الطريقة، ونحن نقدم مقارنة تنقية CFTR في دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) و 1 tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1'-RAC-الجلسرين) (LPG-14). البروتين المنقى في DDM بهذه الطريقة يظهر النشاط أتباز في المقايسات الفنية. البروتين المنقى في LPG-14 يظهر نقاء عالية والغلة، ويمكن استخدامها لدراسة التعديلات بعد متعدية، ويمكن استخدامها لأساليب الهيكلية مثل زاوية صغيرة تشتت الأشعة السينية والمجهر الإلكتروني. ومع ذلك فإنه يعرض أقل بكثير النشاط أتباز.
التليف الكيسي (CF) هو اضطراب وراثي الأكثر شيوعا في أوروبا وأمريكا الشمالية مع حدوث حوالي 1 في 2،500 ولادة حية. يحدث عندما CF الطفرات في الكيسي منظم عبر الغشاء التليف تصرف (CFTR) بروتين يسبب فقدان وظيفتها في الغشاء البلازمي للخلايا الظهارية 1. نتيجة أخطر من هذا العيب هو الضرر الرئة لا رجعة فيه، والذي يقصر العمر المتوقع للمرضى إلى <40 سنة من العمر 2،3.
CFTR هو الكاسيت ATP ملزم (ABC) نقل التي تطورت لتصبح 1،4 القناة الايونية. على الرغم من وظيفتها غيرت تماما في غشاء البلازما من الخلايا، فإنه لا يزال يحتفظ تناظر تسلسل كبيرة مع النقل ABC الأخرى. يثير الاهتمام والفضول، وأجزاء المتخصصة CFTR (أي منطقتها التنظيمية والتي وN-C-تيرميني) تبادل جود تشابه كبير مع تسلسل metazoan أخرى نقل ABC، وبالتالي ليست هناك أدلة إلى الأصول (ه) من هذه المتتاليات في CFTR. على أساس الهيكل الأساسي، وتصنف CFTR كعضو C-عائلة من عائلة نقل ABC، ولكن ليس هناك أدلة قوية على وجود صلة وظيفية المتبقية لهذه الأسرة الفرعية. كانت هناك بعض التقارير عن نشاط النقل الجلوتاثيون لCFTR 5-7، والتي سيكون متسقا مع أدوار أعضاء الأسرة الآخرين C-8،9، على الرغم من أن تقارير أخرى تشير إلى أن انخفاض الجلوتاثيون قد تمنع نشاط CFTR أتباز، بدلا من إظهار التحفيز التي يسببها الركيزة التي تميز النقل ABC 10. قياس أيون تصرف حساسة بما فيه الكفاية للسماح للقناة النشاط من الجزيئات CFTR واحد لدراستها 1 وتم رصدها خصائص القناة CFTR بوصفها وظيفة من الوقت ودرجة الحرارة، وتركيز ATP، غشاء المحتملة، والدولة الفسفرة، وكذلك في بحضور مجموعة من مثبطات جزيء صغير، potentiators، والمعدلات. هؤلاءوأضافت الدراسات أيضا إلى حد كبير في معرفتنا كيف تعمل شركات النقل ABC. ومع ذلك، فقد ثبت التعبير عن CFTR بكميات كبيرة وتنقية لاحقة لتكون تحديا من نوع خاص، وقد تم نجاح تقتصر على عدد قليل من المختبرات 10-13.
الحاجة إلى تطوير عقاقير أكثر فعالية والضغط، ولكن تم عرقلة هذه العملية من خلال عدم وجود CFTR تنقيته لفحص الجزيئات الصغيرة. أن حل مشكلة التعبير CFTR وتنقية تمكين فحص المخدرات عالية الإنتاجية التي تهدف إلى تصحيح الخلل الأساسي في CF وسيفتح أيضا طريقا للدراسات الهيكلية عالية الدقة لإبلاغ تصميم الأدوية العقلاني. وعلاوة على ذلك، لا تزال حتى الخصائص الكيميائية الحيوية الأساسية نسبيا من البروتين، مثل حالته من oligomeric وظيفية، والبروتينات التفاعل والنشاط أتباز سيئة تتميز. لقد ذكرت سابقا بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من GFP وصاحب الموسومة CFTR الفئرانفي S. الخباز 14 والآن مزيد تصف بروتوكولات لتنقية CFTR. وقد استخدمنا هذه الطرق لتنقية خمسة orthologues من CFTR، والبيانات الحالية لتنقية CFTR الدجاج كمثال على ذلك. اختيار المنظفات لإذابة وتنقية هو خطوة حاسمة في عملية تنقية أي بروتين الغشاء. بعد فرزهم للذوبان CFTR في عدة المنظفات، فقد اخترنا اثنين من المنظفات المتناقضة لاستخدامها في تنقية. دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM) هو المنظفات غير أيوني التي استخدمت على نطاق واسع للدراسات الهيكلية والوظيفية على حد سواء من بروتينات الغشاء 15-21. المنظفات الأيونية 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات (1'-RAC-الجلسرين) (LPG-14) هو كفاءة عالية في الانحلالية من CFTR وسبق استخدامها في تنقية البروتينات الغشاء وظيفية 10، 22،23، بما في ذلك تنقية CFTR من S. الخباز 24. </ ع>
وصفناها سابقا وسيلة لoverexpression من CFTR الفئران 14. منذ نشر هذا البروتوكول، أبدينا وتنقيته عدة orthologs مختلفة من CFTR باستخدام نفس النظام. جميع orthologs اختبار تنقيته حتى الآن بشكل جيد في المنظفات غاز البترول المسال، في حين أظهرت تنقية DDM مزيد من التباين عبر orthologs مختلفة (لا تظهر البيانات). يوضح هذه المرونة قوة النهج الخميرة: من الممكن أن يحجب العديد من بنيات مع سرعة النسبية في النظام لاختيار واحد لغرض معين.
غسل microsomes الخميرة مع العازلة التي تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم قبل الإذابة مع نتائج DDM في إعداد صغرور أنظف ويقلل من الملوثات في مراحل لاحقة. هذه الخطوة غير ضرورية في البروتوكول غاز البترول المسال كما العينة CFTR النهائي هو> 90٪ نقية دون غسل صغرور. وعلاوة على ذلك، وتنقية في DDM يتطلب عدة تعديلات على مخازن للذوبان وتنقية الثانية، وهي إضافة الجلسرين الزائدة والملح. معا، وهذه الإضافات زيادة كبيرة الربط من البروتين DDM solubilized إلى العمود.
منهجية تنقية DDM لديه مجال للتحسين، لا سيما إزالة الملوثات الرئيسية 40 كيلو دالتون أن يحكم عليها مطياف الكتلة هو، وذلك بسبب الوحيدات الريباسي L3 الخميرة، والذي يظهر أن يكون هناك تقارب المتأصلة للالراتنج النيكل. ليس هناك تسلسل واضح في polyHis البروتين L3، ولكن فحص هيكل 3D به عند منضمة إلى الريبوسوم (PDB = 1FFK) يدل على أن L3 الوحيدات مطوية لديه كتلة polyHis المحتملة. أن هذه الفرقة هي أقل إثارة للمشاكل في مواد تنقية غاز البترول المسال قد يكون راجعا إلى أقسى المنظفات غاز البترول المسال.
على الرغم من أن تنقية في DDM يبدو أن أفقر من أن في غاز البترول المسال والمنظفات أكثر اعتدالا مثل DDM قد يكون أكثر توافقا مع التحليلات الفنية والهيكلية وبالفعل تم استخدامها في العديد من البلورات بالأشعة السينيةدراسات ographic من البروتينات الغشاء 15-21. وعلاوة على ذلك، أشارت نتائجنا إلى أن استخدام غاز البترول المسال يؤدي إلى فقدان وظائف في أتباز CFTR النسبية لتنقية في DDM. وبالتالي فإننا نوصي بروتوكول تنقية القائمة على غاز البترول المسال لتوليد CFTR حيث نقاء أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال في تطبيقات مثل توصيف التعديلات بعد متعدية، أو في توليد الأجسام المضادة، وسيتم اختيار البروتوكول القائم على غاز البترول المسال . من ناحية أخرى في التطبيقات حيث النشاط والدولة الأم بالكامل من البروتين ضروري، فإننا نقترح البروتوكول القائم على DDM كخيار أفضل.
على أن تبرم، يصف هذا البروتوكول طريقة استنساخه لعزل CFTR في المنظفات ثنائي الشحنة وهو LPG-14 أو المنظفات غير الأيونية DDM. على هذا النحو فإنه يشير إلى مجموعة أكبر من الظروف تنقية للCFTR من سبق وذكرت 10-13. بالإضافة مليغرام كميات CFTR تنقيته يمكن أن يكونتم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات عند دمجها مع نظام نمو الخميرة ارتفاع حجم مثل تخمير 20 L وقدرة عالية نظام حصاد الخلايا مثل 6 L سرعة منخفضة الطرد المركزي الدوار. وCFTR حصلت لديه علامة GFP شطورة الذي يسمح رصد سهل من البروتين في مختلف المقايسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية.
كاشف الموضحة في هذه المخطوطة (الدجاج المحتوية على البلازميد CFTR أو خلايا الخميرة المجمدة) ويمكن الحصول عليها من خلال مؤسسة التليف الكيسي (الولايات المتحدة الأمريكية).
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة التليف الكيسي في الولايات المتحدة (CFF) من خلال اتحاد CFTR 3D هيكل. وقد تم تمويل TR قبل studentship المملكة المتحدة CF الثقة، وNC قبل studentship المملكة المتحدة BBSRC. نحن نعترف زملائنا في هيكل اتحاد CFF CFTR 3D لمساعدتهم وتقديم المشورة وللتصميم الدجاج تسلسل CFTR وتنقية به الأمثل كودون.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |