Une méthode pour générer pulmonaire Neutrophilie Utilisation Aerosolized lipopolysaccharide

Summary

Nous décrivons une méthode pour induire une inflammation pulmonaire neutrophile par défi pour lipopolysaccharide aérosol par nébulisation, pour modéliser une lésion pulmonaire aiguë. En outre, des techniques chirurgicales de base pour l'isolement du poumon, l'intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire sont également décrits.

Abstract

Lésion pulmonaire aiguë (ALI) est une maladie grave caractérisée par neutrophilie alvéolaire, avec des options de traitement limitées et une mortalité élevée. Des modèles expérimentaux de ALI sont clé dans l'amélioration de notre compréhension de la pathogenèse de la maladie. Le lipopolysaccharide (LPS) provenant de bactéries à gram positif induit une inflammation neutrophile dans les voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire de la souris. Délivrance pulmonaire efficace des composés tels que le LPS est toutefois difficile à réaliser. Dans l'approche décrite ici, l'administration pulmonaire chez la souris est réalisé par défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS a été dissous en aérosol par un nébuliseur relié à air comprimé. Les souris ont été exposées à un flux continu d'aérosol de LPS dans une boîte en plexiglas pendant 10 minutes, puis 2 min après le conditionnement aérosol a été abandonnée. L'intubation endotrachéale et lavage broncho-alvéolaire subséquente, suivi par une perfusion de formol a été prochain effectuées, ce qui permet la caractérisation de la p stérileulmonary inflammation. LPS en aérosol génère une inflammation pulmonaire alvéolaire caractérisé par neutrophilie, détecté dans le lavage broncho-alvéolaire et par évaluation histologique. Cette technique peut être mis en place à un faible coût avec quelques appareils, et exige une formation et une expertise minimale. Le système d'exposition peut donc être effectuée systématiquement dans tout laboratoire, avec le potentiel d'améliorer notre compréhension de la pathologie pulmonaire.

Introduction

Le lipopolysaccharide (LPS) est un composant de la paroi cellulaire de bactéries à Gram négatif ^1. Défi au LPS est un modèle bien documenté de lésion pulmonaire aiguë, un syndrome caractérisé par une inflammation neutrophile aiguë et un oedème ^2. En outre, neutrophilie pulmonaire est également une caractéristique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) ^3, et le défi LPS chez l'homme a été utilisé pour modéliser exacerbations de la MPOC ^4. Ainsi, les modèles expérimentaux d'exposition LPS sont des outils pertinents et utiles pour comprendre la pathologie humaine cliniquement.

L'objectif de l'administration pulmonaire de LPS aérosol décrits ici est de générer une réponse inflammatoire neutrophile dans la conduite et les voies respiratoires, sans atteinte systémique. Plusieurs techniques de LPS ont été décrits précédemment. L'injection intra-veineuse de LPS est la voie d'administration la plus couramment utilisée. Bien que cette technique est facilement accessible, til dommages primaires est à l'endothélium, la destruction secondaire de l'épithélium pulmonaire après la migration des neutrophiles dans les poumons. L'administration intra-veineuse provoque également une inflammation systémique ^deux, ce qui peut compliquer le tableau clinique chez des modèles animaux. L'inflammation systémique est en revanche pas observé avec l'administration intra-trachéale. Cette technique, cependant, est beaucoup de travail et nécessite anesthésiques ainsi que la formation considérable ^{5, 6.} En outre, le dépôt pulmonaire par cette voie d'administration dépend de la respiration ^7. Ainsi, le dépôt pulmonaire est affectée par la profondeur de l'anesthésie nécessaires pour l'administration intra trachéale et le dépôt dans les voies aériennes variables peuvent être observées. En revanche, l'administration pulmonaire avec du LPS en aérosol nécessite une formation minimale, et peut facilement être réalisée sur un grand nombre d'animaux avec peu ou pas de variation entre les individus ^{5, 8.}Une étude récente confirme que l'administration par aérosol est supérieure à la voie intra-trachéale à l'égard de dépôt, et que des doses plus pertinentes de LPS induit une inflammation neutrophile ⁸ avec ce modèle.

Des études antérieures ont démontré que défi pour aérosol Pseudomonas aeruginosa LPS génère une réponse inflammatoire marquée dans la lumière des voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire, y compris les espaces alvéolaires ^{9, 10.} L'inflammation est caractérisée par une prédominance de neutrophiles et la présence d'un œdème pulmonaire, et peut ainsi être utilisée pour traiter pathogenèse de la lésion pulmonaire aiguë et obtenir en outre la connaissance des mécanismes qui contribuent à la pathologie de la maladie.

Protocol

Les études chez l'animal ont été approuvés par le comité d'éthique de bien-être animal du Nord de Stockholm. Les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la législation suédoise. 1. Génération d'un aérosol LPS Dissoudre 0,5 g purifiée P. aeruginosa LPS dans 50 ml de solution saline stérile avec agitation douce et vérifier dissolution. Diluer 1 ml de LPS en solution dans 9 ml de solution saline stérile, à une concen…

Representative Results

Défi d'aérosol P. aeruginosa LPS donne généralement une réponse inflammatoire marqué dans la lumière des voies aériennes et de l'espace alvéolaire, caractérisé par une prédominance de neutrophiles aux deux points de temps précoces et tardifs. Aérosol LPS induit neutrophilie pulmonaire Souris C57BL / 6BY et BALB / c ont été exposées à des aérosols P. aeruginosa LPS ou du véhicule et les neutrophiles ont été dénombrées…

Discussion

LPS en aérosol génère une réponse inflammatoire dans les voies respiratoires, caractérisé par des neutrophiles dans la muqueuse epitheliale, les espaces entourant les voies respiratoires conductrices, ainsi que les espaces alvéolaires. Ce est, avec la teneur en protéines totales ont augmenté dans BALF, indicatif de fuite plasmatique, représentant de la pathologie de la lésion pulmonaire aiguë. Comme LPS induit une inflammation stérile, la réaction est indépendante de la réponse immunitaire adaptative, et…

Materials

Name of the material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used.
Pari LC sprint star nebulizer	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI mass flowmeter 4040	TSI	4040	Alternative product from supplier may be used.
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube	Sigma-Aldrich	Z685704	Recomended brand.
Plexiglas boxes with removable lids	Custom built	N/A	150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side).
3M Half Facepiece Reusable Respirator	3M	7503	Recomended brand.
3M Advanced Particulate Filters (P100)	3M	2291	Recomended brand.
Sissors	VWR	233-1104	Preferred scissors may be used.
Forceps	VWR	232-1313	Preferred forceps may be used.
Intramedic PE50 polyethylene tube	BD	427411	Recomended brand.
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread	VWR	95056-992	Recomended brand.
26 ½  gage needle			Alternative suppliers exist.
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile	BD	301025	Alternative suppliers exist.
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene	BD	301035	Alternative suppliers exist.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Alternative suppliers exist.
Türk's solution	Merck Millipore	109277
Table top centrifuge			Alternative manufacturers exist.
Cytospin 4 cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	Alternative centrifuge can be used.
HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Alternative staining kits exists.
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Alternative suppliers exist.