Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em> In Vivo</em
Summary
GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.
Abstract
Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Il meccanismo fisiologico alla base è una depolarizzazione delle fibre afferenti primarie mediate da GABAergici sinapsi axo-assonale (primaria depolarizzazione afferente). La forza di primaria depolarizzazione afferente può essere misurata mediante registrazione dei potenziali volumi condotto alla radice dorsale (potenziali radice dorsale, DRP). Le alterazioni patologiche di inibizione presinaptica sono cruciali nella elaborazione centrale anormale di alcune condizioni di dolore e in alcuni disturbi di ipereccitabilità del motore. Qui, si descrive un metodo di registrazione DRP in vivo nei topi. La preparazione del midollo spinale radici dorsali nella procedura di registrazione utilizzando elettrodi di aspirazione animale anestetizzato e sono spiegato. Questo metodo permette di misurare GABAergica DRP e quindi stimare inibizione presinaptica spinale nel topo vivente. In combinazione con modelli di topi transgenici, la registrazione DRP può serve come un potente strumento per studiare associata a malattia del midollo fisiopatologia. In vivo la registrazione ha diversi vantaggi rispetto alle ex vivo isolato preparazioni midollo spinale, ad esempio, la possibilità di registrazione simultanea o manipolazione di reti sopraspinali e induzione di DRP dalla stimolazione dei nervi periferici.
Introduction
Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Inibisce potenziali postsinaptici eccitatori (EPSPS) in motoneuroni monosinaptica eccitati senza modificare il potenziale di membrana post-sinaptica e l'eccitabilità dei motoneuroni 1-3. Depolarizzazione afferenti primari (PAD) indotta da GABAergici sinapsi axo-assonale su fibre presinaptiche sensoriali è il meccanismo sottostante 4-7 (vedi anche Figure1a). Queste sinapsi contengono GABA A e GABA B recettori GABA A (R e GABA B R). Attività GABA A R porta ad un aumento della conduttanza cloruro che suscita PAD dovuto alla distribuzione ione locale. Questo blocca depolarizzazione la propagazione dei potenziali d'azione nei terminali dell'assone e riduce la loro forza con conseguente riduzione del Ca 2 +-afflusso e una riduzione del rilascio trasmettitore. Attivazione dei recettori GABA B non fat contribuiscono al PAD ma porta ad una riduzione di Ca 2 +-afflusso migliorando così inibizione presinaptica. Mentre l'attivazione di GABA A R sembra essere coinvolto nella inibizione breve termine, GABA B R sono coinvolti nella modulazione a lungo termine 8-10. Oltre al GABA, che rappresenta la maggior parte del PAD e l'inibizione presinaptica, altri sistemi di trasmettitori possono anche modulare e contribuire a questo meccanismo 11,12.
Alterazioni patologiche inibizione presinaptica sembrano determinanti in diversi stati patologici esempio infiammazione periferica e dolore neuropatico 13,14, così come anormale trasformazione dolore centrale 15, lesioni del midollo spinale 16, e malattie del SNC con ipereccitabilità motore mediata da difettoso trasmissione GABAergica 17, 18. Pertanto, la stima inibizione presinaptica la pena di indagare sulle condizioni patologiche sperimentali a livello del midollo spinale in vivo </em>. PAD dà luogo a potenziali volumi condotti forniscono una misura diretta della inibizione presinaptica nel midollo spinale. Tali potenzialità sono chiamati potenziali radici dorsali (DRP) e possono essere misurati dal spinale radice spinale dorsale dopo stimolazione delle radici dorsali adiacenti 7.
Le prime misure di DRP sono stati riportati in gatti e rane 19 e sono state intensamente studiate nei gatti da Eccles, Schmidt e altri nei primi anni 1970 3,4,20,21. Mentre le registrazioni in vivo di DRP nei gatti 22 e 23 ratti sono stati ampiamente utilizzati, misurazioni nei topi sono stati condotti quasi esclusivamente in ex vivo isolato preparazioni midollo spinale 15,24. Qui, descriviamo un metodo per registrare DRP in topi anestetizzati in vivo permette una misura diretta di inibizione presinaptica nell'organismo intatto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Registrazioni-extra e intracellulari elettrofisiologici di attività neuronale e potenziali sinaptici in vivo sono allo stato dell'arte delle tecniche di indagine delle funzioni neuronali del sistema nervoso centrale e fisiopatologia. Integrazione spinale è fondamentale per la funzione motoria, ad esempio, il movimento degli arti e per la percezione sensoriale multimodale. Inibizione presinaptica è un meccanismo fondamentale in questo processo computazionale garantire risposte adeguate a input se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Manfred Heckmann per utili discussioni durante stabilisce il metodo. Inoltre, ringraziamo Claudia Sommer per l'assistenza tecnica e Frank Schubert per il supporto la produzione del video. Il lavoro è stato supportato dal Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF), Germania, FKZ: 01EO1002 e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) di Jena University Hospital.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
- Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
- Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
- Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
- Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
- Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
- Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
- Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
- Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
- Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
- Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
- Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
- Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
- Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
- Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
- Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
- Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
- Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
- Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
- Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
- Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
- Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
- Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
- Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
- Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).
