Summary
GABAergique inhibition présynaptique est un mécanisme inhibiteur puissant de la moelle épinière et le moteur important pour l'intégration du signal sensoriel dans les réseaux de la moelle épinière. Sous-jacent afférent primaire dépolarisation peut être mesurée par l'enregistrement des potentiels de la racine dorsale (DRP). Ici, nous démontrons une méthode d'enregistrement de DRP in vivo chez la souris.
Abstract
Inhibition présynaptique est l'un des mécanismes inhibiteurs les plus puissants de la moelle épinière. Le mécanisme physiologique sous-jacent est une dépolarisation des fibres afférentes primaires médiées par GABAergiques synapses axo-axonale (dépolarisation afférente primaire). La force de la dépolarisation afférente primaire peut être mesurée par l'enregistrement des potentiels de volume menée à la racine dorsale (potentiels de la racine dorsale, DRP). Les modifications pathologiques de l'inhibition présynaptique sont cruciales dans la centrale anormale de certaines conditions de la douleur et dans certains troubles de moteur hyperexcitabilité. Ici, nous décrivons un procédé d'enregistrement DRP in vivo chez la souris. La préparation de la moelle épinière racines dorsales chez l'animal anesthésié et la procédure d'enregistrement à l'aide des électrodes d'aspiration sont expliqués. Cette méthode permet de mesurer GABAergique DRP et ainsi estimer inhibition présynaptique de la moelle chez la souris vivante. En combinaison avec des modèles de souris transgéniques, l'enregistrement peut se DRPrve comme un outil puissant pour étudier la maladie associée à la moelle physiopathologie. enregistrement in vivo a plusieurs avantages par rapport aux ex vivo des préparations isolées de la moelle épinière, par exemple la possibilité d'enregistrer ou de manipulation de réseaux supraspinales et induction de DRP par la stimulation des nerfs périphériques simultanément.
Introduction
Inhibition présynaptique est l'un des mécanismes inhibiteurs les plus puissants de la moelle épinière. Il inhibe potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSPS) dans motoneurones monosynaptique excités sans modifier le potentiel de membrane post-synaptique et l'excitabilité des motoneurones 1-3. Dépolarisation afférente primaire (PAD) induite par GABAergiques synapses axo-axonale sur des fibres présynaptiques sensorielles est le mécanisme sous-jacent 4-7 (voir aussi Figure1a). Ces synapses contiennent GABA A et GABA B-récepteurs GABA A (R et GABA B R). Activité GABA A R conduit à une augmentation de la conductance du chlorure PAD qui provoque en raison de la distribution des ions local. Cette dépolarisation bloque la propagation des potentiels d'action dans les terminaisons axonales et réduit leur force conduisant à une diminution de Ca 2 + afflux et une réduction de la libération du transmetteur. L'activation des récepteurs GABA B ne fait past contribuent au PAD mais conduit à une diminution de Ca 2 +-afflux améliorant ainsi l'inhibition présynaptique. Bien que l'activation de GABA A R semble être impliquée dans l'inhibition à court terme, le GABA B R sont impliqués dans la modulation à long terme 8-10. En plus de GABA, qui représente la majeure partie de la MAP et l'inhibition présynaptique, d'autres systèmes de transmetteurs peuvent également moduler et à contribuer à ce mécanisme 11,12.
Des changements pathologiques dans l'inhibition présynaptique semblent être crucial dans plusieurs états pathologiques par exemple inflammation périphérique et la douleur neuropathique 13,14, ainsi que le traitement de la douleur centrale anormale 15, lésions de la moelle épinière 16, et les maladies du système nerveux central avec une hyperexcitabilité du moteur médiée par défaut la transmission GABAergique 17, 18. Ainsi, l'estimation de l'inhibition présynaptique est utile d'étudier les conditions pathologiques expérimentales sur le niveau de la moelle épinière in vivo 7.
Premières mesures de DRP ont été rapportés chez les chats et les grenouilles 19 et ont été intensément étudié chez les chats par Eccles, Schmidt, et d'autres dans le début des années 1970 3,4,20,21. Alors que les enregistrements in vivo de DRP chez les chats et les rats 22 23 ont été largement utilisés, les mesures chez la souris ont été réalisées presque exclusivement dans les préparations isolées ex vivo de la moelle épinière 15,24. Ici, nous décrivons une méthode pour enregistrer DRP chez la souris in vivo anesthésié permettant une mesure directe de l'inhibition pré-synaptique dans l'organisme intact.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales mentionnées dans le protocole suivant a été approuvé par les autorités de l'Etat de Thuringe (Thüringer LANDESAMT für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).
Une. Préparatifs pour l'expérience
- La fabrication des électrodes d'aspiration
- Tirez une micropipette en utilisant un capillaire en verre borosilicate standard avec un extracteur micropipette, par exemple une électrode de raccordement standard.
- Frein l'électrode à la pointe diamètre de 0,5 à 1 mm (légèrement plus grand que le diamètre des racines dorsales) à l'aide d'un fichier de diamant.
- vernis à chaleur de la pointe afin de ne pas nuire à la racine dorsale quand il est aspiré po Une torche de laboratoire standard convenir.
- Monter le filament de verre sur un support d'électrode connecté à une seringue à travers lequel la pression négative peut être appliquée.
- Préparation des solutions
- anesthésie par injection chez la souris: Mélanger 0,75 ml de kétamine 10%, 0,24 ml de xylazine 2%e 5 ml saline à 0,9%. 10 ul / g de poids corporel (BW) de la solution sera injectée par voie intrapéritonéale (ip).
- Liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF): Diluer dans de l'eau distillée deux fois les sels suivants (en mm): NaCl 134; KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2; NaHCO 3 25; CaCl2 2, D- glucose 10. Ajouter H 2 O 2 à une concentration finale de 0,003%. Utiliser toujours solution fraîchement préparée.
- Préparation de la configuration d'enregistrement (figure 2)
- Connectez l'amplificateur à une interface PC pour numériser les données.
- Utilisez un programme basé sur PC ou une minuterie analogique pour déclencher un stimulateur de créneau et d'acquisition de données sur le disque dur du PC.
- Utilisez silverwires chlorée connectés au porte-électrodes de verre standards pour la stimulation et l'enregistrement.
- Assemblez trois manipulateurs pour la stimulation, l'enregistrement et l'électrode de référence respectivement autour d'un stèreotactic trame pour les souris, de sorte que toutes les électrodes ont accès à la moelle épinière préparé par la suite.
- Connectez tuyaux et des seringues pour les porte-électrodes à être pomme pour appliquer une pression négative.
2. Observations générales pour l'expérimentation animale et la préparation des animaux pour la procédure d'enregistrement
- Effectuez toutes les expériences utilisant des souris selon les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation respective. Effectuer toutes les interventions chirurgicales et les enregistrements sous anesthésie profonde assurant que la souffrance des animaux est réduite au minimum.
- Anesthésier l'animal par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine (125 mg et 8 mg par g BW de kétamine et de xylazine, respectivement, 10 ul / g BW de la solution préparée comme décrit ci-dessus). Si nécessaire pendant les enregistrements à long terme, des injections supplémentaires peuvent être faites ip ou im
Remarque: répétitives im injections de 0,05-0,1 ml de solution de kétamine / xylazine dans le haut des cuisses se sont révélés être adaptépour garder l'animal en anesthésie profonde jusqu'à 3 h. - Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Fixer la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique et d'utiliser un coussin chauffant avec sonde rectale et boucle réflexe de contrôler la température du corps de l'animal lors de l'expérience. Fixation de la moelle épinière dans un cadre stéréotaxique n'est pas nécessaire.
- Avant de commencer la préparation, vérifiez la profondeur de la narcose par réflexe du clignement de paupières et secousses entre les orteils des souris. Réflexes devraient être abolies.
- Ouvrez la peau le long de la ligne médiane au-dessus de la moelle épinière au niveau thoracique haut en bas la région lombaire pour obtenir un champ opérationnel clair à l'aide d'un scalpel. Ne pas utiliser des ciseaux pour faire des incisions cutanées. Perdre soigneusement la peau à partir du tissu sous-jacent. Au cours des étapes ultérieures de garder la plaie humide de 0,9% de solution saline.
- Couper les tendons et les tissus conjonctifs de chaque côté des vertèbres lombaires à partir de niveaux thoraciques en utilisant un scalpel et ciseaux. Retirez les apophyses épineuses et le reste du tissu conjonctif autour des vertèbres à l'aide d'une petite pince.
- Casser délicatement vertèbres avec la pince à partir de niveaux lombaires (L4/L5) de sous un microscope à dissection. Shove la pointe de la pince dans l'espace entre les vertèbres et la moelle épinière et soulever des morceaux d'os en dehors. Ne pas nuire à la mère et éviter la pression de la moelle épinière. Les deux sont essentiels pour le succès. Gardez la moelle épinière humide durant toute la procédure. Procéder à des niveaux mi-thoraciques.
3. Séparation des racines dorsales et DRP enregistrement (Figure 2)
- Ouvrez la dure-mère soigneusement à l'aide d'une aiguille fine (30 G) avec une pointe recourbée. Utilisez aCSF pour humidifier à partir de maintenant.
- Séparer les racines dorsales, autant que possible en utilisant le gabarit et couper deux racines adjacentes distale que possible. Vigoureuse traction sur les racines au cours de la séparation affecte le succès de l'expérience.
- Abaisser l'électrode d'aspiration vers le doRSAL racines. Ajouter autant aCSF à la moelle épinière que possible parce que le liquide permet d'aspirer les racines dorsales.
- Aspirer l'extrémité d'une racine dorsale coupée dans une pipettes en verre par application d'une pression négative par l'intermédiaire d'une seringue. Si nécessaire, déplacer la racine dorsale en avant de l'ouverture de l'électrode à l'aide d'une aiguille fine.
- Si la racine dorsale est sec à l'intérieur de l'électrode d'aspiration, ajouter un peu de aCSF à la pointe tout en suçant soigneusement jusqu'à ce que la pipette est suffisamment rempli aCSF.
- Après la racine dorsale est aspiré, puis soulever la pointe de l'électrode à partir de la moelle épinière. Veillez à ce que non "pont d'eau" entre la pointe de la pipette et la moelle épinière de court-circuit l'électrode d'enregistrement / stimulation.
- Répétez les étapes 3.3 à 3.6 pour une racine adjacente ipsilatéral.
- Placez l'électrode de référence aussi proche que possible de la racine dorsale et le garder humide en appliquant aCSF.
- En établissant la configuration de l'enregistrement, une racine est déjà choisi pour la stimulation, lal'autre pour l'enregistrement. Augmenter la tension par étapes lors de l'enregistrement de la deuxième racine dorsale se fait en mode pince de courant. On peut remarquer une déviation courte vers le bas qui est suivie d'une lente durable déviation, vers le haut représentant de la DRP.
- Régler la tension de relance pour supramaximal niveaux et enregistrer plusieurs balayages (au moins 20 - 30 balayages / racine dorsale à 0,1 Hz, filtre entre 0,3 Hz à 3 kHz).
- Enregistrez trains courts de trois stimuli (100 Hz) pour obtenir des informations sur la somme en fonction du temps de la DRP.
- Mettez l'enregistrement et le site de stimulation pour les enregistrements controlatérale supplémentaires.
- Les animaux ne sont pas destinés à survivre à l'opération. Sacrifier des animaux après le dernier enregistrement par décapitation tout en restant sous anesthésie profonde (kétamine / xylazine, voir ci-dessus, l'étape 2.2).
4. Analyse des données
- Transférer des données à un programme d'analyse (par exemple Sigma Plot, Igor Pro, ou MATLAB).
- Calculer traces moyens frOM 20-30 balayages.
- Prendre l'amplitude maximale de la déviation de la tension (à partir de la ligne de base; DRP pic d'amplitude) pour une analyse ultérieure (figure 3).
- Calculer le rapport de l'amplitude crête DRP après trois impulsions et une seule impulsion pour obtenir une mesure de la somme dépend des potentiels ultérieurs de temps.
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Representative Results
Traces DRP typiques sont présentés dans la figure 3. L'artefact de stimulation importante est généralement suivie d'une déviation vers le bas à court. Par la suite, une longue durée de déviation vers le haut lent, représentant le DRP se distingue nettement. Dans un sous-ensemble d'enregistrements, dorsales réflexes profondes sont visibles sous forme de petites pointes sur le dessus de la DRP. Chez les souris de type sauvage normales, réflexes racines dorsales apparaissent le plus souvent lorsque la tension de stimulation est excessive. Comme les réflexes de racine dorsale ne peuvent pas être prouvés avec une grande reproductibilité dans cette préparation, ils n'ont pas été prélevés pour analyse et on a pris soin de réduire la tension de stimulation au plus bas, mais la force encore supramaximal. Pour une analyse de DRP amplitudes de crête, moyenne des traces de 20-30 balayages successifs sont utilisés (Figure 3a). Les amplitudes des pics DRP peuvent être calculées par rapport aux valeurs initiales avant l'artefact de stimulation.
La somme en fonction du temps de la DRP peut être analysée répétitif stimulations (3 stimuli; 100 Hz; Figure 3b). L'amplitude de crête est calculé en fonction de la seule expérience de stimulation. Le rapport des amplitudes après un seul et trois stimulations à haute fréquence donne une estimation de la somme en fonction du temps de la PAD.
Figure 1. Des schémas de voies de la moelle épinière PAD-associés et de la configuration d'enregistrement. Une. Le diagramme montre la voie schématique d'inhibition présynaptique de la moelle épinière après une stimulation de racine dorsale (3). Dépolarisation afférente primaire (PAD) est médiée par l'activation d'un groupe de neurones de premier ordre (1) et l'inhibition GABAergique consécutivement par un interneurone inhibiteur d'une synapse axo-axonale sur Ia afférentes fibres (2). Potentiels de la racine dorsale (DRP) tenir compte de la PAD, diffuser par voie électronique le long de la racine dorsale et ont été enregistrées près de l'entrée de la moelle épinière (4). B. L'acquisition des données est faite par un logiciel d'ordinateur personnel exécutant PatchMaster (1) en utilisant un LIH 8 8 d'interface d'ordinateur (2). Les signaux de tension de l'amplificateur universel ELC (7) sont numérisées à 10 kHz. La stimulation est déclenchée par un signal TTL commander une S88 double sortie carré impulsion stimulateur (3). des impulsions de tension sont appliqués par l'intermédiaire d'une électrode d'aspiration (4). L'électrode d'enregistrement est connecté à un préamplificateur (6). Un fil d'argent chloruré est utilisé pour la terre (5). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2.Enregistrement DRP in situ. Une. La moelle épinière de la souris anesthésiée est exposée, la dure-mère enlevée, et humidifié avec du liquide céphalorachidien artificiel. Les électrodes d'aspiration (1: 2; électrode de stimulation: électrode d'enregistrement,) sont positionnés sur la moelle épinière. L'encart montre la moelle épinière (flèche noire) et les racines dorsales (flèches bleues). Les racines dorsales sont séparées, coupé, et aspirés dans les pointes des électrodes (1,2). B. Les pointes des pipettes contenant les racines dorsales (encastrés, flèches jaunes) doivent être soigneusement élevée à partir de la surface de la moelle épinière, de sorte qu'ils ne sont pas en contact avec le fluide environnant. Étirement des racines dorsales et toucher la moelle épinière doit être évitée (a et b: stimulation électrode 1; électrode d'enregistrement 2; électrode de référence 3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs. Une. Moyenné enregistrement (panneau de gauche) de 28 traces consécutives (panneau de droite) d'une paire de racines dorsales. L'artefact de stimulation (1) est suivi d'un potentiel négatif prolongé (2, vers le haut), ce qui reflète la DRP. Dans certains enregistrements, battement de coeur (ECG) est considéré comme un artefact (panneau de droite, flèches rouges), mais peut être clairement différenciée de la DRP. Traces avec des artefacts ECG chevauchement superposées à la DRP doivent être exclus de l'analyse. B. Stimulation répétitive (3 stimuli, 10 Hz) conduit à une sommation en fonction du temps de la DRP (abscisse est agrandie pour clarifier sommation temporelle). C. Exemple enregistrements de DRP avant (ligne noire) et 5 min après (ligne rouge) localeapplication de la GABAergique bloqueur bicucullin (0,5 mM, 500 pi) sur la moelle épinière exposée. Blocage des interneurones GABAergiques locaux conduit à une baisse marquée de DRP amplitude crête confirmant origine GABAergique du potentiel enregistrée (noter l'artefact de 50 Hz sinusoïdal dans la courbe rouge qui se produit de temps en temps pendant DRP dans l'enregistrement in vivo et peut parfois ne pas être empêché même par une bonne mise à la terre et blindage).
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Discussion
Enregistrements électrophysiologiques extra-et intracellulaires de l'activité neuronale et potentiels synaptiques in vivo sont l'état de l'art des techniques pour enquêter sur les fonctions neuronales du système nerveux central et la physiopathologie. Spinal intégration est critique pour la fonction motrice, par exemple, les mouvements des membres et de la perception sensorielle multimodale. Inhibition présynaptique est un mécanisme essentiel dans ce processus de calcul assurer des réponses appropriées aux entrées sensorielles. Synapses GABAergiques sur fibres afférentes Ia inhibent l'excitation des motoneurones par PAD. La racine dorsale potentiel d'enregistrement in vivo ouvre la possibilité de mesurer directement PAD chez l'animal intact. Cette technique pourrait être d'un intérêt particulier pour la recherche liée à des états pathologiques dans lesquels l'inhibition de la moelle anormale est pertinente comme la douleur, des blessures de la moelle épinière, une lésion nerveuse périphérique, ou une inflammation. En combinaison avec l'utilisation de modèles de souris génétiquement modifiés cette technique peut être forte au invemécanismes sous-jacent stigate perturbés inhibition de la moelle. La méthode ici surmonte certaines limites de la variante d'enregistrements DRP chez la souris à l'aide de préparations isolées de la moelle épinière. Ainsi, les voies de réseaux supraspinales sont conservés et également une analyse combinée de l'activité neuronale de la moelle et supraspinal est possible. L'effet de l'activité sur supraspinal PAD peut être étudiée par la stimulation électrique parallèle des centres cérébraux respectifs. En outre, DRP peut être évoqué par la stimulation des nerfs périphériques directement, ce qui pourrait présenter un intérêt dans des modèles animaux de lésion du nerf périphérique ou une inflammation. Utilisation de l'anesthésie proprement dit, de vigilance et de contrôle de la température, les enregistrements peuvent être effectuées pendant des heures dans l'animal intact dans des conditions physiologiques.
En revanche, par rapport à l'utilisation des préparations isolées de la moelle épinière, l'enregistrement in vivo de DRP est limité dans une certaine mesure en ce qui concerne l'application locale de médicament contrôlée et la perfusion de bain de telle sortelution. Les médicaments peuvent être appliquées par voie topique, mais en raison de la diffusion dans le tissu environnant incertain, l'échange de solution de variable et la quantité de solution dans la préparation d'enregistrement, il n'est pas possible de contrôler la concentration du médicament à l'intérieur de la moelle épinière et le site d'enregistrement. Lorsque les effets aigus de l'application de surface sont étudiées, ces limites peuvent être partiellement résolus par l'application locale à travers des pipettes.
La moelle épinière de souris est faible, très sensible à la pression et à la torsion, et la chirurgie est difficile. Par conséquent, la préparation de moelle épinière de souris pour l'électrophysiologie in vivo besoin d'une formation. Il ya certains points critiques. Il est essentiel que, lors de la préparation de la dure-mère n'est pas endommagé et que de préférence pas ou du moins très peu de pression est appliquée à la moelle épinière. La moelle épinière est conservée humidifiée pendant toute la procédure, avant et après l'ouverture de la dure-mère avec du NaCl et aCSF, respectivement. Le rapport signal sur bruitrapport des enregistrements DRP peut être augmentée par la stimulation et l'enregistrement le plus près possible de la pointe de la racine dorsale d'entrée respectif. Diligent terre et le blindage de la configuration d'enregistrement aide à réduire le bruit non spécifique, lampes de microscope de dissection doivent être éteints ou retirés pendant l'enregistrement.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Manfred Heckmann pour des discussions utiles lors de l'établissement de la méthode. De plus, nous remercions Claudia Sommer pour l'assistance technique et Frank Schubert pour support la production de la vidéo. Le travail a été soutenu par le Ministère fédéral de l'Education et de la Recherche (BMBF), Allemagne, FKZ: 01EO1002 et le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) de l'hôpital universitaire de Iéna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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