Måling Spinal presynaptiske Hemming i mus ved Dorsal Root Potential Recording<em> I Vivo</em
Summary
Gabaergic presynaptisk hemming er en kraftig hemmende mekanisme i ryggmargen viktig for motorisk og sensorisk signal integrasjon i ryggmargs nettverk. Underliggende primære afferente depolarisering kan måles ved opptak av dorsal root potensialer (DRP). Her vi vise en metode for in vivo opptaket av DRP i mus.
Abstract
Presynaptisk inhibering er en av de mest kraftfulle inhiberende mekanismer i ryggmargen. Den underliggende fysiologiske mekanismen er en depolarisering av primære afferente fibre mediert av gabaergic axo-aksonale synapser (primære afferente depolarisering). Styrken av primær afferent depolarisering kan måles ved opptak av volum utført potensialer på dorsal root (dorsal root potensialer, DRP). Patologiske forandringer av presynaptisk hemming er avgjørende i unormal sentral behandling av visse smertetilstander og i noen forstyrrelser i motor hypereksitabilitet. Her beskriver vi en fremgangsmåte for innspilling DRP in vivo i mus. Utarbeidelse av ryggmargs Dorsalrøttene i bedøvet dyret og opptaksprosedyre bruke suge elektroder blir forklart. Denne metoden gjør det mulig å måle gabaergic DRP og dermed estimere spinal presynaptisk hemming i den levende mus. I kombinasjon med transgene musemodeller, kan DRP opptak serve som et kraftig verktøy for å undersøke sykdomsassosierte rygg patofysiologi. In vivo opptak har flere fordeler sammenlignet med ex vivo isolerte ryggmargen preparater, for eksempel muligheten for samtidig opptak eller manipulering av supra nettverk og induksjon av DRP ved stimulering av perifere nerver.
Introduction
Presynaptisk inhibering er en av de mest kraftfulle inhiberende mekanismer i ryggmargen. Det hemmer eksitatoriske postsynaptiske potensialer (EPSPS) i monosynaptically glade motoneurons uten å endre den postsynaptiske membran potensial og oppstemthet av motoneurons 1-3. Primær afferent depolarisering (PAD) indusert av gabaergic axo-aksonale synapser på sensoriske presynaptiske fibrene er den underliggende mekanismen 4-7 (se også Figure1a). Disse synapser inneholder GABA A-og GABA B-reseptorer (GABA A R og GABA B R). GABA A R-aktivitet fører til en økning i klorid-konduktans, som utløser PAD på grunn av den lokale fordeling ion. Dette depolarisering blokker utbredelsen av aksjonspotensialer inn i axon terminaler og reduserer sin styrke som fører til en redusert Ca 2 +-tilstrømningen og en reduksjon av senderen utgivelsen. Aktivering av GABA B-reseptorer gjør ingent bidra til PAD, men fører til en reduksjon av Ca 2 +-tilstrømningen dermed styrke presynaptisk hemming. Mens aktivering av GABA A R synes å være involvert i kortsiktige hemming, er GABA B R involvert i langsiktig module 8-10. I tillegg til GABA, som står for hoveddelen av PAD og presynaptisk hemming, kan andre sendere systemer også modulere og bidra til denne mekanismen 11,12.
Patologiske endringer i presynaptiske hemming synes å være viktig i flere sykdomstilstander, for eksempel perifer inflammasjon og nevropatisk smerte 13,14, samt unormal sentral smertebehandling 15, ryggmargsskade 16 og CNS-sykdom med motor hyperexcitability mediert av defekte GABAergic transmisjon 17, 18. Således er verdt estimering presynaptisk inhibering å undersøke eksperimentelle patologiske tilstander på ryggmargen nivået in vivo </em>. PAD gir opphav til volum gjennomført potensialer som gir et direkte mål på den presynaptiske hemming i ryggmargen. Disse potensialene kalles dorsal root potensialer (DRP) og kan måles fra ryggmargen Dorsalrøttene etter stimulering av tilstøtende Dorsalrøttene 7.
Første målinger av DRP er rapportert hos katter og frosker 19 og ble nøye studert i katter etter Eccles, Schmidt, og andre i begynnelsen av 1970-tallet 3,4,20,21. Mens in vivo opptak av DRP i katter 22 og rotter 23 har blitt mye brukt, målinger i mus har vært nesten utelukkende utført i ex vivo isolerte ryggmargen forberedelser 15,24. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å spille inn DRP i bedøvede mus in vivo, slik at en direkte måling av presynaptisk inhibering i den intakte organisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekstra-og intracellulære elektrofysiologiske opptak av neuronal aktivitet og synaptiske potensialer in vivo er state of the art teknikker i å undersøke CNS nevrale funksjoner og patofysiologi. Spinal integrering er viktig for motorisk funksjon, f.eks lem bevegelse og for multimodal sensorisk persepsjon. Presynaptisk hemming er en kritisk mekanisme i denne beregningsprosess sikrer hensiktsmessige tiltak mot sanseinntrykk. Gabaergic synapser på Ia afferente fibre hemme eksitasjon av motoneurons av PA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Manfred Heckmann for nyttige diskusjoner under etablering av metoden. Videre takker vi Claudia Sommer for teknisk assistanse og Frank Schubert for støtte produsere videoen. Arbeidet ble støttet av den føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF), Tyskland, FKZ: 01EO1002 og Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) av Jena universitetssykehus.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
- Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
- Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
- Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
- Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
- Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
- Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
- Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
- Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
- Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
- Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
- Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
- Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
- Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
- Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
- Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
- Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
- Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
- Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
- Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
- Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
- Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
- Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
- Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
- Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).
