En Mikrofluid Teknik til sonde Cell deformerbarhed
Summary
Vi demonstrere en mikrofluidik-assay til måling af tidshorisonten for celler til transit gennem en sekvens af mikron-skala forsnævringer.
Abstract
Her detaljeret udformning, fremstilling og anvendelse af en mikrofluidindretning at evaluere deformerbarhed af et stort antal individuelle celler på en effektiv måde. Typisk kan data for ~ 10 2 celler kan erhverves inden for en 1 time eksperiment. En automatiseret billedanalyse program muliggør effektiv post-eksperiment analyse af billeddata, så behandling for at være fuldstændig inden for et par timer. Vores apparat geometri er unik ved, at celler skal deformere gennem en række micron skala forsnævringer, hvorved den indledende deformation og tidsafhængig lempelse af individuelle celler, der skal analyseres. Anvendeligheden af denne metode til human promyelocytisk leukæmi (HL-60) celler er påvist. Kørsel celler til at deformere gennem micron skala forsnævringer hjælp af tryk-drevet flow, observere vi, at den menneskelige promyelocytiske (HL-60) celler momentant okkludere første indsnævring til en median tid på 9,3 msek før passage hurtigere gennem den efterfølgende snøreioner med en median transittid på 4,0 msek pr konstriktion. Derimod all-trans-retinsyre-behandlede (neutrofil-type) HL-60-celler okkludere første indsnævring kun 4,3 msek før passage gennem de efterfølgende indsnævringer med en median transittid på 3,3 msek. Denne metode kan give indsigt i den viskoelastiske natur af celler, og i sidste ende afslører de molekylære oprindelsen af denne adfærd.
Introduction
Ændringer i celleform er kritiske i mange biologiske sammenhænge. For eksempel, erythrocytter og leukocytter deformere gennem kapillærer, der er mindre end deres egen diameter 1. I metastase skal kræftceller deformere gennem smalle interstitielle huller samt indviklet karsystem og lymfe netværk til frø på sekundære steder 2. Til at sondere den fysiske opførsel af de enkelte celler, præsentere mikrofluidenheder en ideel platform, der kan tilpasses til at studere en række celle adfærd, herunder deres evne til at vandre gennem smalle huller 3 og til passivt at deformere gennem micron skala forsnævringer 3- 9. Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidenheder er optisk transparent, så celle deformationer skal visualiseres ved hjælp af lys mikroskopi og analyseres ved hjælp af grundlæggende billedbehandling værktøj. Desuden kan arrays af forsnævringer være præcist defineret, så analyse af flere celler samtidig med etgennemløb, der overstiger mange eksisterende teknikker 10,11.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol til sondering celle deformerbarhed ved hjælp af 'Cell Deformer' PDMS mikrofluidindretning. Enheden er designet således, at cellerne passage gennem sekventielle indsnævringer; denne geometri er almindelig i fysiologiske sammenhænge, såsom pulmonal kapillærbane 12. At måle celle deformerbarhed, transit tid giver en bekvem metrik, der er let måles som den tid, der kræves for en individuel celle til transit gennem en enkelt indsnævring 4,6. For at opretholde et konstant trykfald over de trange kanaler under celle forsendelse, vi bruger trykdrevet strømning. Vores protokol indeholder detaljerede instruktioner om enheden design og fabrikation, enhedens drift efter trykdrevet strømning, forberedelse og billeddannelse af celler, samt billedbehandling til at måle tiden for celler at deformere gennem en række forsnævringer. Vi inkludererbåde enhedens design og forarbejdning vision data kode som supplerende filer. Som et repræsentativt udsnit af data, viser vi celle transittid gennem en serie af indsnævringer som en funktion af antallet af indsnævringer passeret. Analyse af tidsplanen for celler til transit selvom smalle forsnævringer af en mikrofluid enhed kan afsløre forskelle i deformerbarheden af en række celletyper 4,5,13. Enheden demonstreret her entydigt overvåger celle transit gennem en serie af micron skala forsnævringer; dette motiv emulerer snoet vej at celler opleve i omløb, og giver også mulighed for sondering yderligere fysiske egenskaber af celler, såsom afslapning tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her giver vi et omfattende eksperimentelle procedure til analyse af deformation af celler i transit gennem trange mikrofluidkanaler anvendelse af tryk-drevet flow. En MATLAB script muliggør automatiseret databehandling (supplerende materiale); en opdateret version af koden opretholdes ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mere generelt kan de teknikker, der præsenteres her, tilpasses i mange cellebaserede mikrofluide analyser, inklusive effekten af cytoskele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Lloyd Ung til konstruktive bidrag i tidlige versioner af denne teknik, Dr. Jeremy Agresti for pres cap design tips, og Dr. Dongping Qi for hans hjælp i opdigte trykdækslet. Vi er taknemmelige for laboratorier M. Teitell og P. Gunaratne for at levere en bred vifte af celleprøver til test. Vi er taknemmelige for National Science Foundation (KARRIERE Award DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center og UCLA Clinical and Translational Science Institute for at støtte dette arbejde.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
