En mikroflödesteknik till probcell Deformationsklass
Summary
Vi visar en mikrofluidik-baserad analys för att mäta tidsplanen för celler att passera genom en sekvens av micron skala förträngningar.
Abstract
Här kommer vi i detalj konstruktion, tillverkning och användning av en mikrofluidanordning för att utvärdera deformerbarheten av ett stort antal enskilda celler på ett effektivt sätt. Normalt kan data för ~ 10 2 celler förvärvas inom en 1 timme experiment. En automatiserad bildanalys programmet möjliggör effektiv efter experiment analys av bilddata, så att behandlingen vara klar inom några timmar. Vår anordning geometri är unik i det att cellerna måste deformeras genom en serie av mikron-skale förträngningar och därigenom möjliggöra den initiala deformationen och tidsberoende relaxation av individuella celler som skall analyseras. Tillämpningen av denna metod för att den mänskliga promyelocytisk leukemi (HL-60) celler demonstreras. Körning celler att deformeras genom micron skala förträngningar som använder tryckdriven strömning, observerar vi att den mänskliga promyelotiska (HL-60) celler tillfälligt täppa första sammandragning under en mediantid på 9,3 msek före passaging snabbare genom den efterföljande sammandrajoner med en median transittiden för 4,0 msek per sammandragning. Däremot, all-trans-retinsyra-behandlade (neutrofil-typ) HL-60-celler ockludera den första förträngningen endast 4,3 ms innan ympa om genom de efterföljande förträngningar med ett median transittid av 3,3 msek. Denna metod kan ge en inblick i den viskoelastiska natur celler, och i slutändan avslöja de molekylära ursprunget till detta beteende.
Introduction
Förändringar i cellform är kritiska i många biologiska sammanhang. Till exempel, erytrocyter och leukocyter deformeras genom kapillärer som är mindre än sin egen diameter 1. I metastas, måste cancerceller deformeras genom smala interstitiell luckor samt slingriga kärl och lymfatiska nätverk till utsäde på sekundära platser 2. För att undersöka den fysiska beteendet hos enskilda celler, mikrofluidikanordningar presentera en idealisk plattform som kan anpassas för att studera en rad olika cell beteenden inklusive deras förmåga att migrera genom smala spalter 3 och passivt deformeras genom micron skala förträngningar 3- 9. Polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidikanordningar är optiskt transparent, så att cell deformationer som ska visualiseras med ljusmikroskop och analyseras med hjälp av grundläggande bildbehandlingsverktyg. Dessutom kan arrayer av förträngningar definieras exakt, vilket möjliggör analys av flera celler samtidigt med engenomströmning som överstiger många existerande tekniker 10,11.
Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för undersökning cell deformerbarhet med hjälp av "Cell Deformer 'PDMS mikroflödessystem enhet. Enheten är utformad så att celler passage genom sekventiella förträngningar; denna geometri är vanligt i fysiologiska sammanhang, till exempel lung kapillärbädd 12. För att mäta cell deformerbarhet, ger transittid ett bekvämt mått som lätt mäts som den tid som krävs för en enskild cell till transit genom en enda sammandragning 4,6. För att upprätthålla ett konstant tryckfall över den förträngda kanaler under celltransit använder vi tryckdrivet flöde. Vår protokoll innehåller detaljerade instruktioner om enheten design och tillverkning, enhetens funktion av tryckdriven strömning, förberedelse och avbildning av celler, samt bildbearbetning för att mäta tiden för celler att deformeras genom en serie av förträngningar. Vi inkluderarbåde enhets design och visioner databehandlingskoden som tilläggsfiler. Som ett representativt urval av uppgifter, visar vi celltransittiden genom en serie av förträngningar som en funktion av antalet förträngningar passe. Analys av tidsplanen för celler till transit men smala förträngningar i ett mikroflödessystem enhet kan avslöja skillnader i deformerbarhet av olika celltyper 4,5,13. Enheten demonstreras här granskar unikt cell transit genom en serie micron skala förträngningar; denna design emulerar den slingrande banan att celler upplever i cirkulation och gör det också möjligt att sondera ytterligare fysikaliska egenskaper hos de celler såsom relaxationstid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi en omfattande experimentell förfarande för att analysera deformationen av celler som transiteras genom dragna mikrofluidikkanaler använder tryckdriven strömning. Ett MATLAB-skript möjliggör automatisk databehandling (Supple Material); en uppdaterad version av koden bibehålls ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mer allmänt kan de metoder som presenteras här anpassas i många cellbaserade mikroflödesanalyser, inklusive effekten av cytoske…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Lloyd Ung för konstruktiv insats i tidiga versioner av denna teknik, Dr Jeremy Agresti för tryck cap design tips, och Dr Dongping Qi för hans hjälp vid tillverkning av trycklock. Vi är tacksamma för laboratorier M. Teitell och P. Gunaratne för att få olika cellprover för att testa. Vi är tacksamma till National Science Foundation (KARRIÄR Award DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, och UCLA klinisk och translationell Science Institute för att stödja detta arbete.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
