Vi visar en mikrofluidik-baserad analys för att mäta tidsplanen för celler att passera genom en sekvens av micron skala förträngningar.
Här kommer vi i detalj konstruktion, tillverkning och användning av en mikrofluidanordning för att utvärdera deformerbarheten av ett stort antal enskilda celler på ett effektivt sätt. Normalt kan data för ~ 10 2 celler förvärvas inom en 1 timme experiment. En automatiserad bildanalys programmet möjliggör effektiv efter experiment analys av bilddata, så att behandlingen vara klar inom några timmar. Vår anordning geometri är unik i det att cellerna måste deformeras genom en serie av mikron-skale förträngningar och därigenom möjliggöra den initiala deformationen och tidsberoende relaxation av individuella celler som skall analyseras. Tillämpningen av denna metod för att den mänskliga promyelocytisk leukemi (HL-60) celler demonstreras. Körning celler att deformeras genom micron skala förträngningar som använder tryckdriven strömning, observerar vi att den mänskliga promyelotiska (HL-60) celler tillfälligt täppa första sammandragning under en mediantid på 9,3 msek före passaging snabbare genom den efterföljande sammandrajoner med en median transittiden för 4,0 msek per sammandragning. Däremot, all-trans-retinsyra-behandlade (neutrofil-typ) HL-60-celler ockludera den första förträngningen endast 4,3 ms innan ympa om genom de efterföljande förträngningar med ett median transittid av 3,3 msek. Denna metod kan ge en inblick i den viskoelastiska natur celler, och i slutändan avslöja de molekylära ursprunget till detta beteende.
Förändringar i cellform är kritiska i många biologiska sammanhang. Till exempel, erytrocyter och leukocyter deformeras genom kapillärer som är mindre än sin egen diameter 1. I metastas, måste cancerceller deformeras genom smala interstitiell luckor samt slingriga kärl och lymfatiska nätverk till utsäde på sekundära platser 2. För att undersöka den fysiska beteendet hos enskilda celler, mikrofluidikanordningar presentera en idealisk plattform som kan anpassas för att studera en rad olika cell beteenden inklusive deras förmåga att migrera genom smala spalter 3 och passivt deformeras genom micron skala förträngningar 3- 9. Polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidikanordningar är optiskt transparent, så att cell deformationer som ska visualiseras med ljusmikroskop och analyseras med hjälp av grundläggande bildbehandlingsverktyg. Dessutom kan arrayer av förträngningar definieras exakt, vilket möjliggör analys av flera celler samtidigt med engenomströmning som överstiger många existerande tekniker 10,11.
Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för undersökning cell deformerbarhet med hjälp av "Cell Deformer 'PDMS mikroflödessystem enhet. Enheten är utformad så att celler passage genom sekventiella förträngningar; denna geometri är vanligt i fysiologiska sammanhang, till exempel lung kapillärbädd 12. För att mäta cell deformerbarhet, ger transittid ett bekvämt mått som lätt mäts som den tid som krävs för en enskild cell till transit genom en enda sammandragning 4,6. För att upprätthålla ett konstant tryckfall över den förträngda kanaler under celltransit använder vi tryckdrivet flöde. Vår protokoll innehåller detaljerade instruktioner om enheten design och tillverkning, enhetens funktion av tryckdriven strömning, förberedelse och avbildning av celler, samt bildbearbetning för att mäta tiden för celler att deformeras genom en serie av förträngningar. Vi inkluderarbåde enhets design och visioner databehandlingskoden som tilläggsfiler. Som ett representativt urval av uppgifter, visar vi celltransittiden genom en serie av förträngningar som en funktion av antalet förträngningar passe. Analys av tidsplanen för celler till transit men smala förträngningar i ett mikroflödessystem enhet kan avslöja skillnader i deformerbarhet av olika celltyper 4,5,13. Enheten demonstreras här granskar unikt cell transit genom en serie micron skala förträngningar; denna design emulerar den slingrande banan att celler upplever i cirkulation och gör det också möjligt att sondera ytterligare fysikaliska egenskaper hos de celler såsom relaxationstid.
Här ger vi en omfattande experimentell förfarande för att analysera deformationen av celler som transiteras genom dragna mikrofluidikkanaler använder tryckdriven strömning. Ett MATLAB-skript möjliggör automatisk databehandling (Supple Material); en uppdaterad version av koden bibehålls ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Mer allmänt kan de metoder som presenteras här anpassas i många cellbaserade mikroflödesanalyser, inklusive effekten av cytoske…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för Lloyd Ung för konstruktiv insats i tidiga versioner av denna teknik, Dr Jeremy Agresti för tryck cap design tips, och Dr Dongping Qi för hans hjälp vid tillverkning av trycklock. Vi är tacksamma för laboratorier M. Teitell och P. Gunaratne för att få olika cellprover för att testa. Vi är tacksamma till National Science Foundation (KARRIÄR Award DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, och UCLA klinisk och translationell Science Institute för att stödja detta arbete.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
LabView System Design Software | National Instruments | ||
Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |