חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em> באתר</em> הכלאה בזחל ים צמד ים
Summary
Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.
Abstract
לאחר פגיעה בחוט השדרה שלמה, lampreys הים בראשון משותק מתחת לרמה של חיתוך רוחב. עם זאת, הם להתאושש תנועה לאחר מספר שבועות, וזה מלווה בהתחדשות מרחק קצר (כמה מ"מ) של האקסונים propriospinal ואקסונים מקרינים שדרה מגזע המוח. בין 36 הנוירונים מקרין שדרת זיהוי גדול, חלקם regenerators טוב ואחרים הם regenerators רע. יכולים בקלות להיות מזוהים ביותר נוירונים אלה בהכנות למערכת עצבים המרכזיות wholemount. על מנת להבין את מנגנוני נוירון הפנימי שמעדיפים או לעכב התחדשות האקסון לאחר פציעה בחוליות במערכת העצבים המרכזית, אנו קובעים הבדלים בביטוי הגנים בין regenerators הטוב ורע, וכיצד ביטוי מושפע מחיתוך רוחב חוט השדרה. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחל דיור וlampreys ים הבוגר הפך לאחרונה במיכלי מים טרי, הפקת transections חוט השדרה שלמה תחת חזון מיקרוסקופי, והכנת brעין וwholemounts חוט השדרה לכלאה באתר. בקצרה, מוחזקי בעלים חיים ביום 16 ב ° C ומורדם ב1% benzocaine ברינגר צמד ים. חוט השדרה הוא transected עם המספריים iridectomy באמצעות גישת גב ובעלי החיים מותר להתאושש במיכלי מים טרי ב23 ° C. לכלאה באתר, בעלי החיים reanesthetized והמוח וחוט שהוסרו באמצעות גישת גב.
Introduction
ביונקי פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שמוביל לאובדן קבוע של תפקוד מתחת לאתר של פציעה כי האקסונים נפצעו לא להתחדש דרך אזור הטראומה ולהתחבר מחדש למטרות המתאימות. בניגוד ליונקים, lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. 1 מעניין, יש לי lampreys סט של 36 חוט השדרה מקרין נוירונים כי הם אישי מזהים בכל הר הכנות מוח בגללם גודל גדול 2,3 (איור 1) . כל הנוירונים מקרין שדרה אלה axotomized על ידי חיתוך רוחב חוט השדרה מלא ברמה גבוהה. המחקרים קודמים של הקבוצה ואחרים שלנו הראו כי אפילו בנוכחות של החלמה תפקודית לאחר SCI חלק מהנוירונים האלה להראות יכולת התחדשות נמוכה מאוד (הם נחשבים "regenerators הרע"), בעוד שאחרים בדרך כלל להתחדש האקסון שלהם דרך האתר של פציעה (הם נחשבים גרם "regenerators ood "). 2,3 מאפיין זה הופך את lampreys מודל חוליות מעניין ללמוד את ההבדלים בביטוי הגנים בין תאי עצב מקרין שדרת regenerator הטוב והרע, כי בתורו יובילו להבדלים ביכולת ההתחדשות הפנימית של תאי עצב המנסה להתחדש האקסונים שלהם באותה הסביבה חיצונית. 1
שימוש במודל זה יש לנו הראה בעבר כי תאי עצב עם ביטוי מופע יכולת משובי נמוך של קולטני מולקולת הדרכת axonal כמו UNC5 4,5 וneogenin, 6 אשר מתווכים את הפעולה המעכבת של netrin וRGM בהתאמה מקרינה שדרה. בנוסף, על ידי שימוש בשיטה זו הקבוצה שלנו הראתה גם כי רק regenerators הטוב להראות התאוששות של הביטוי של neurofilaments לאחר הפציעה ובמהלך תהליך ההתחדשות. לאחרונה, בוש ו7 מורגן הראו על ידי immunofluorescence שregenerators הרע להראות increasביטוי עורך של סינוקלאין לאחר פציעה, שספר על ידי המחברים לעובדה שתאי העצב מקרין השדרה "regenerator הרע" למות לאט לאחר 5,7,8 חיתוך רוחב חוט השדרה מלא. אז, מודל צמד ים של פגיעה בחוט השדרה שלמה התפתח כמודל שימושי מאוד להבין מה גורם נוירון כבל מקרין השדרה "regenerator רע" לאחר axotomy.
לבצע המחקרים שלנו אנו מבצעים פרוטוקול מלא בעמוד השדרה חיתוך רוחב כבל ניתוח ונתיחת מוח אחורי בנקודות הזמן הרצויות לאחר פציעה לבצע wholemount הכלאה באתר. במאמר המתודולוגי הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע התקין של ניתוח פגיעה בחוט השדרה מלא בlampreys הזחל, התחזוקה הבאה של בעלי החיים ונתיחה הסופית המוח והכנת המוח לwholemount הכלאה באתר. פרוטוקול מפורט לperform wholemount הכלאה באתר במוח של lampreys זחל כבר דווח בעבר. 9 בנוסף, פרוטוקול זה לפגיעה בחוט השדרה ומוח לנתיחה יכול לשמש גם לאחר מכן לעבד את המוח לאימונוהיסטוכימיה או שיטות היסטולוגית אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע חיתוך רוחב מלא בחוט השדרה ומוח אחורי לנתיחה בlampreys ים זחל. הליך זה מאפשר הבדלי ניתוח בביטוי גנים בין חוט השדרה לזיהוי תאי עצב מקרינים לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות מוח כל ההר בכלאה באתר. השלב הקריטי בהליך הוא הביצוע הנכון של חיתוך ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R., McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
