इसके बाद wholemount के लिए पूरी स्पाइनल कॉर्ड चोट और मस्तिष्क विच्छेदन प्रोटोकॉल<em> बगल में</em> लारवल सागर एक प्रकार की मछली में संकरण
Summary
Lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. हालांकि, कुछ रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स अच्छा regenerators हैं और दूसरों को नहीं कर रहे हैं. इस पत्र में पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन उत्पादन और स्वस्थानी संकरण में लिए wholemount दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों की तैयारी, आवास समुद्र एक प्रकार की मछली लार्वा (और हाल ही में तब्दील वयस्क) के लिए तकनीक दिखाता है.
Abstract
एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद, पहली बार में समुद्र lampreys transection के स्तर से नीचे लकवा मार जाता है. हालांकि, वे कई हफ्तों के बाद हरकत की वसूली, और इस propriospinal axons और brainstem से रीढ़ की हड्डी में पेश axons की कम दूरी उत्थान (कुछ मिमी) के साथ है. 36 बड़ी पहचान योग्य रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के अलावा, कुछ अच्छा regenerators हैं और दूसरों को बुरा regenerators हैं. ये न्यूरॉन्स सबसे आसानी से wholemount सीएनएस तैयारी में पहचाना जा सकता है. एहसान कि न्यूरॉन आंतरिक तंत्र को समझने या रीढ़ सीएनएस में चोट के बाद अक्षतंतु उत्थान को बाधित करने के लिए, हम अच्छे और बुरे regenerators के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का निर्धारण, और कैसे अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी transection से प्रभावित है. इस पत्र में सूक्ष्म दृष्टि के तहत पूरा रीढ़ की हड्डी लेनदेन का निर्माण, और बी आर तैयारी, ताजा पानी के टैंक में आवास लार्वा के लिए तकनीक और हाल ही में तब्दील वयस्क समुद्र lampreys दिखाता हैऐन और स्वस्थानी संकरण में के लिए रीढ़ की हड्डी wholemounts. संक्षेप में, जानवरों 16 में रखा जाता है सी ° और एक प्रकार की मछली घंटी में 1% Benzocaine में anesthetized. रीढ़ की हड्डी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से iridectomy कैंची के साथ transected है और पशु 23 डिग्री सेल्सियस पर ताजा पानी के टैंक में ठीक करने के लिए अनुमति दी है. स्वस्थानी संकरण में के लिए, जानवरों reanesthetized रहे हैं और मस्तिष्क और रस्सी एक पृष्ठीय दृष्टिकोण के माध्यम से हटा दिया.
Introduction
स्तनधारियों में रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) घायल axons आघात क्षेत्र के माध्यम से पुनर्जन्म और उनके उचित लक्ष्यों को जोड़ने नहीं है क्योंकि चोट की साइट से नीचे समारोह की स्थायी नुकसान होता है कि एक विनाशकारी स्थिति है. स्तनधारियों के विपरीत, lampreys एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद हरकत ठीक हो. 1 दिलचस्प है, lampreys क्योंकि उनके बड़े आकार 2,3 (चित्रा 1) के मस्तिष्क की तैयारी माउंट पूरे 36 रीढ़ की हड्डी में व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने योग्य हैं कि न्यूरॉन्स पेश का एक सेट है . इन रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के सभी एक उच्च स्तरीय पूरा रीढ़ की हड्डी transection द्वारा axotomized रहे हैं. हमारे समूह और अन्य लोगों की पिछले अध्ययनों से दूसरों को आमतौर पर चोट की साइट के माध्यम से अपने अक्षतंतु को पुनर्जीवित करते हुए भी इन न्यूरॉन्स के कुछ एक बहुत कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने एससीआई के बाद कार्यात्मक वसूली की उपस्थिति में, (वे "बुरा regenerators" माना जाता है) पता चला है कि (वे विचार कर रहे हैं "जीई regenerators "). 2,3 यह विशेषता lampreys बारी में करने का प्रयास है कि न्यूरॉन्स की आंतरिक पुनर्योजी क्षमता में अंतर को बढ़ावा मिलेगा कि अच्छे और बुरे रिजनरेटर रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प हड्डीवाला मॉडल बनाता है एक ही बाह्य वातावरण में अपने axons पुनर्जन्म. 1
हम पहले से पता चला है कि इस मॉडल का उपयोग रीढ़ की हड्डी में पेश क्रमश netrin और RGM की निरोधात्मक कार्रवाई मध्यस्थता जो UNC5 4,5 और neogenin, 6 की तरह axonal मार्गदर्शन अणु रिसेप्टर्स की कम पुनर्योजी क्षमता दिखाने अभिव्यक्ति के साथ न्यूरॉन्स. इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग करके अपने समूह में भी केवल अच्छा regenerators चोट के बाद और उत्थान की प्रक्रिया के दौरान neurofilaments की अभिव्यक्ति का एक वसूली चलता है कि दिखाया गया है. हाल ही में, बुश और मॉर्गन 7 बुरा regenerators एक बढ़ाने बताते हैं कि immunofluorescence से पता चला है"बुरा सुधारनेवाला" रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन्स धीरे धीरे एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection 5,7,8 के बाद मर जाते हैं तथ्य यह है कि लेखकों द्वारा संबंधित दिया गया है जो चोट के बाद synuclein की एड अभिव्यक्ति,. तो, एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की एक प्रकार की मछली मॉडल एक रीढ़ की हड्डी में पेश न्यूरॉन axotomy के बाद एक "बुरा सुधारनेवाला" क्या करता है समझने के लिए एक बहुत ही उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है.
हम स्वस्थानी संकरण में wholemount प्रदर्शन करने के लिए चोट के बाद वांछित समय बिंदुओं पर एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection सर्जरी प्रोटोकॉल और एक पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन कर रहे हैं हमारे अध्ययन का संचालन करने के लिए. वर्तमान पद्धति लेख में हम लार्वा lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी में चोट की सर्जरी के समुचित निष्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, पशुओं के बाद रखरखाव और स्वस्थानी संकरण में एक wholemount के लिए अंतिम मस्तिष्क विच्छेदन और मस्तिष्क की तैयारी. एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेलार्वा lampreys के मस्तिष्क में स्वस्थानी संकरण में wholemount rform जैसा कि पहले बताया गया है. 9 इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी में चोट और मस्तिष्क विच्छेदन के लिए इस प्रोटोकॉल भी तो immunohistochemistry या अन्य ऊतकीय तरीकों के लिए दिमाग पर कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम लार्वा समुद्र lampreys में एक पूरा रीढ़ की हड्डी transection और पीछे मस्तिष्क विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह प्रक्रिया स्वस्थानी संकरण में एक साबुत माउंट मस्तिष्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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