評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em>インビトロ</em> HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力
Summary
HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.
Abstract
The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.
Introduction
HIV-1病因および疾患の進行に影響を与える宿主およびウイルス両方の特性を決定することは、合理的なワクチン設計のために最も重要である。細胞性免疫応答は、HIV-1感染に対するヒトの免疫応答の重要な構成要素である。細胞傷害性Tリンパ球（CTL）は、急性ウイルス血症の初期制御のために必要であり、ホストが定常状態（セットポイント）ウイルス量1,2を確立することを可能にする。これらのエフェクター細胞の実験的な枯渇は、ウイルスコントロール3,4の損失をもたらす。これにもかかわらず、エスケープ変異は、ウイルス感染細胞5-9のCTL認識を覆すウイルスゲノム内で発生する。
特定のHLA対立遺伝子は、より低いウイルス負荷およびB * 57、B * 27、B * 81の10-15を含む遅い疾患進行と関連している。 HLAクラスI対立遺伝子の保護の利益の一部は、彼らがそのようなGagのようなゲノムの機能的に制約された領域を標的とするという事実に帰することができる及びインビトロ 16-21 で複製するウイルスの能力を減少させ、エスケープ突然変異を選択します。細胞性免疫系からの脱出は、私は対立の選択HLAクラスとの関連でウイルスに有益であるが、これらの変異の効果は、HLAミスマッチ22,23の個人に送信時にホストの差分結果をもたらす可能性がある。そのため、ウイルス複製能力に送信されたHLA-関連したエスケープ変異の影響を理解することは、初期のHIV-1の病因の理解を促進するために重要であろう。
多くの進歩は、私が24〜29の対立遺伝子特異的HLAクラスに関連付けられた個別のエスケープ変異の適応度の欠陥を特定し、特徴づけるために作られているが、天然に存在するHIV-1分離株は、おそらく、HLAから生じる、HLA関連多型のユニークで複雑 な足跡を持っている別の免疫遺伝学的背景30の媒介免疫圧力。 apにrevious分析、Goepfert ら 。 88急性感染ザンビアに由来して送信ギャグ配列におけるHLA関連変異の蓄積がセットポイントウイルス量31の減少と関連していることを示した。これは、HLA-ミスマッチの受信者へのGag特異的で有害なエスケープ突然変異の送信は、臨床的利点を提供し、そしてウイルス複製を弱毒化することによるものであり得ることを示唆した。今後、このような複製能力、および早期の複製が今度は、HIV-1臨床パラメータと後期に影響を与える可能性のある方法として、送信されたウイルスの特性を定義するために協調してどのように動作するか、複雑なギャグ多型の組み合わせ、天然に存在する分離株の中勉強することが不可欠です病因。
ブロックマンらは、最初のサブタイプCとBの感染の両方で慢性期の感染とウイルス量の間に単離さギャグ-プロ配列の複製能力の間のリンクを実証した32-35。これらの研究で示された実験的なアプローチは、慢性的に感染した個体に由来する配列のin vitro複製能力を調べるための適切なものの、困難なサブタイプC急性感染した個体におけるHIV-1複製の能力を研究するいくつかの技術的な注意事項や制限事項があります。この方法は、研究室では、ウイルスストック36を適応、LAVの一部が元になって、サブタイプB NL4-3プロウイルスの中に人口ベースのPCR増幅された配列の組換えに依存しています。ウイルス産生は、PCRアンプリコンとCEM系T細胞株37の同時トランスフェクションによって達成し、デルタのgag-プロ NL4-3 DNAを消化し た。この方法は、潜在的に生体内でのウイルス準種に関連して回収されたウイルス株の本質をゆがめるため、in vitroでの複製能力の測定を変えること、数週間から数ヶ月の期間にわたってウイルスの増殖を必要とします。このメソッドは、私それが効果的に最も高い複製能力を持つウイルスのために選択され、ここで、慢性感染者が多数から多数の異なるウイルス変異株のクローンを作成すると、非常に労働集約的であるため現実的ではない場合には、慢性的に感染した個体を研究するためのより適切だ。しかし、急性感染個体内の、一般的に一から二の変種が存在であり、従って、 インビトロ選択圧を通じて回収されたウイルス株の本質をゆがめる危険性を排除し、in vitroでの複製能力をより正確に評価することができます。第二に、この方法では、サブタイプB派生バックボーンにサブタイプC ギャグ-プロ配列が再結合が必要であり、分析にバックボーンの非互換性の偏りをもたらす可能性があります。により、これらの制限のために、配列の大きな番号が導入された潜在的なバイアスを克服するために分析しなければならない。
ここでは、代替実験的アプロを記述サブタイプC急性感染した個体に由来する配列を研究するための適切なACH。私たちは、サブタイプCプロウイルス骨格、MJ4へのHIV-1サブタイプC感染者の急性感染時点から派生gag遺伝子を導入するために、制限酵素ベースのクローニング戦略を使用しています。 ギャグの遺伝子をクローニングすることで一般的なバックボーンとしてMJ4の使用は、サブタイプC由来配列の分析のために重要である。 MJ4は、一次分離株38から導出され、したがって、原因バックボーンおよびgag遺伝子間のサブタイプの非互換性にバイアスを導入する可能性が低いであろう。また、酵素に基づく制限クローニングを使用してのアプローチは、293T細胞に直接トランスフェクトするプロウイルス構築物について、およびクローン化されたgag配列と同一のクローン性ウイルスストックの回収を可能にする。
以下に提示された方法は、派生ギャグ-MJ4サブタイプCの複製能力を評価するためのハイスループット法であるキメラウイルス。 293T細胞へのトランスフェクションは、簡単であり、ウイルスの回収は、わずか3日かかります。 インビトロ複製能力は、ブロックマンらによって作成された同じCEM-CCR5ベースのT細胞株でアッセイされる。37が、成功した複製に必要な重要なプロトコルの変更を使用して、サブタイプC MJ4キメラウイルスの。むしろPBMCをより適切なT-細胞株の使用は、高いアッセイ再現性試験すべきサブタイプC MJ4-キメラウイルス多数のを可能にする。最後に、上清中のウイルスの定量化のために放射性標識逆転写酵素アッセイを使用して、市販のp24 ELISAキットを使用するよりもコスト効率である。また、同じアッセイ内および分離株の間でのレプリケーションの微妙な違いを検出するためのウイルスを複製し、両方の悪い、高度を検出するために重要であった、より高いダイナミックレンジを与える。
結論として、ここで紹介する方法が可能にしたザンビアからの急性感染した個体のHIV-1サブタイプCから派生ギャグ配列の複製能力の詳細な調査、および書かれたように、他のサブタイプC感染集団を研究するために拡張することができる。異なる分離株のGag間の複製能力のばらつき度が高いが観察された。さらに、当社は送信されたギャグの複製能力とセットポイントウイルス量だけでなく、3年間で39以上のCD4 +の減 少との間の統計的関連性を示すことができた。このような結果は、そのような複製能力としてどのように、送信さウイルスの特性を研究することの重要性を強調初期感染時に病原性に影響を与えるために、宿主の免疫系と相互作用して、効果的なワクチンの介入だけでなく、治療を開発するための一体化されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
により長さとこのプロトコルの技術的な性質のために、キメラギャグ-MJ4プラスミドの構築の成功の両方のためだけでなく、ウイルス複製能力の定量化のために重要である、いくつかのステップがあります。このプロトコルで概説MJ4への外来ギャグ遺伝子の導入のための制限酵素ベースのクローニング戦略は以前に使用され再結合に基づく方法に対して多くの利点を有しているが、重要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The investigators thank all the volunteers in Zambia who participated in this study and all the staff at the Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka who made this study possible. The investigators would like to thank Jon Allen, Smita Chavan, and Mackenzie Hurlston for technical assistance and sample management. We would also like to thank Dr. Mark Brockman for his discussions and generous donation of the GXR25 cells.
This study was funded by R01 AI64060 and R37 AI51231 (EH) and the International AIDS Vaccine Initiative. This work was made possible in part by the generous support of the American people through the United States Agency for International Development (USAID). The contents are the responsibility of the study authors and do not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government. This work also was supported, in part, by the Virology Core at the Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC and JP were supported in part by Action Cycling Fellowships. This work was supported in part by the Yerkes National Primate Research Center base grant (2P51RR000165-51). This project was also funded in part by the National Center for Research Resources P51RR165 and is currently supported by the Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| PCR reagents | |||
| GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3' |
IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3' |
IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3' | IDT DNA | Custom Oligo | 25nmol, standard desalt |
| CoolRack PCR 96 XT | Biocision | BCS-529 | |
| CoolRack M15 | Biocision | BCS-125 | |
| Nuclease free water | Fisher | SH30538FS | Manufactured by Hyclone |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | |
| Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap) | Daigger | EF3647BX | |
| SuperScript III one-step RT-PCR system | Life Technologies/Invitrogen | 12574035 | |
| Phusion Hot-start II DNA polymerase | Fisher | F-549L | |
| PCR Nucleotide Mix | Roche | 4638956001 | |
| Agarose, high gel strength | Fisher | 50-213-128 | |
| TAE 10X | Life Technologies/Invitrogen | AM9869 | |
| Promega 1kb DNA ladder | Fisher | PRG5711 | Manufactured by Promega |
| Sybr Safe DNA Gel Stain, 10000x | Life Technologies/Invitrogen | S33102 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Razor blades, single-edged | Fisher | 12-640 | Manufactured by Surgical Design |
| Thermocycler, PTC-200 | MJ Research | ||
| Microbiology & Cloning reagents | |||
| LB Agar, Miller | Fisher | BP1425-2 | |
| LB Broth, Lennox | Fisher | BP1427-2 | |
| Sterile 100mm x 15mm polystyrene petri dishes | Fisher | 08-757-12 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| Falcon 14ml Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| NgoMIV restriction endonuclease | New England BioLabs | R0564L | |
| BclI restriction endonuclease | New England BioLabs | R0160L | |
| HpaI restriction endonuclease | New England BioLabs | R0105L | |
| T4 DNA Ligase, 5U/μL | Roche | 10799009001 | |
| JM109 competent cells, >10^8 cfu/μg | Promega | L2001 | |
| PureYield plasmid miniprep system | Promega | A1222 | |
| Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator | Invitrogen | G6600 | |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Cell culture reagents | |||
| Amphyl cleaner/disinfectant | Fisher | 22-030-394 | |
| Fugene HD, 1 mL | VWR | PAE2311 | Manufactured by Promega |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| Costar Plates, 6-well, flat | Fisher | 07-200-83 | Manufactured by Corning Life |
| Costar Plates, 24-well, flat | Fisher | 07-200-84 | Manufactured by Corning Life |
| Costar Plates, 96-well, round | Fisher | 07-200-95 | Manufactured by Corning Life |
| Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm^2 | Fisher | 10-126-37 | |
| Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm^2 | Fisher | 10-126-34 | Manufactured by Corning Life |
| Conical Tubes, 50ml, blue cap | Fisher | 14-432-22 | Manufactured by BD Biosciences |
| Conical Tubes, 15ml, blue cap | Fisher | 14-959-70C | Manufactured by BD Biosciences |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CI | Manufactured by Mediatech |
| RPMI, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11875-119 | |
| DMEM, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11965-118 | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100X | Life Technologies/Invitrogen | 10378-016 | |
| PBS with magnesium and calcium, 500ml | Life Technologies/Invitrogen | 14040-133 | |
| PBS without magnesium and calcium | Life Technologies/Invitrogen | 20012-050 | |
| Sarstedt tubes, assorted colors | Sarstedt | 72.694.996 | |
| Reservoir Trays for Multichannel, 55ml | Fisher | 13-681-501 | |
| DEAE-Dextran | Fisher | NC9691007 | |
| Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate | Fisher | 07-200-96 | Manufactured by Corning Life |
| HEPES, 1M Buffer Solution | Life Technologies/Invitrogen | 15630-080 | |
| FBS, Defined, 500 ml | Fisher | SH30070 03 | |
| X-gal | VWR | PAV3941 | Manufactured by Promega |
| Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| 1M Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5% | Sigma-Aldrich | F8775-500ML | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387-100G | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | P8131-100G | |
| Allegra X15-R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 1450001 | |
| VistaVision inverted microscope | VWR | ||
| Reverse-Transcriptase Quantification Assay reagents | |||
| dTTP, [α-33P]- 3000Ci/mmol, 10mCi/ml, 1 mCi | Perkin-Elmer | NEG605H001MC | |
| 1M Tris-Cl, pH 8.0 | Life Technologies/Invitrogen | 15568025 | Must be adjusted to pH 7.8 with KOH |
| 2M potassium chloride (KCl) | Life Technologies/Invitrogen | AM9640G | Adjust to 1M solution |
| 0.5M EDTA | Life Technologies/Invitrogen | 15575-020 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11333941103 | |
| Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt | Midland Reagent Co. | P-3001 | |
| Oligo d(T) primer | Life Technologies/Invitrogen | 18418-012 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815-1G | |
| SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small | Perkin-Elmer | 7001485 | |
| Corning Costar Thermowell 96 well plate model (M) Polycarbonate | Fisher | 07-200-245 | Manufactured by Corning Life |
| Corning 96 Well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Fisher | 07-200-684 | Manufactured by Corning Life |
| DE-81 anion exchange paper | Whatman | 3658-915 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-1KG | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FB-CA-810 | |
| Cyclone storage phoshpor screen | Packard |
References
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