Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
O estudo do sistema nervoso (CNS) central de maturação depende de orientação genética de populações neuronais. No entanto, a tarefa de restringir a expressão de genes de interesse para os subtipos neuronais específicos provou extremamente difícil devido à escassez relativa de elementos promotores específicos. Interneurônios GABAérgicos constituem uma população neuronal com ampla diversidade genética e morfológica. De facto, mais de 11 subtipos diferentes de interneurónios sensíveis a GABA têm sido caracterizadas no córtex do rato 1. Aqui apresentamos um protocolo adaptado para direcionamento seletivo das populações GABAérgicos. Conseguimos subtipo direccionamento selectivo de interneurónios sensíveis a GABA, utilizando o elemento potenciador da transcrição homeobox factores Dlx5 e DLX6, os homólogos da distal inferior (Dll) do gene de Drosophila 2,3, para dirigir a expressão de genes específicos dentro do útero por meio de electroporação.
Introduction
A maior parte dos interneurônios GABAérgicos corticais originam de duas estruturas embrionárias transitórias nomeadas as eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE respectivamente) 4. Parvalbumin e somatostatina expressar interneurônios origem no MGE enquanto Calretinina (Cr), Vasointestinal peptídeo (VIP) e Reelin (Re) expressando interneurônios originam do CGE. Estes subtipos Interneuron podem ser distinguidos pelas suas datas de nascimento. MGE subtipos derivados nascem entre o dia embrionário 9.5 (E9.5) e E16.5 5,6. Em contraste, interneurônios CGE derivados nascem E12.5 através E18.5 com sua produção atingindo um máximo de 6 E15.5. A orientação genética dessa população tarde nascido, no entanto, permanece indefinida.
Os (Dlx) genes distal-less murino são exclusivamente expressos no cérebro anterior ventral desenvolvimento 3. Interneurônios GABAérgicos e neurônios de projeção do estriado, mas não células piramidais corticais expressar Dlx1, 2,5, e 6 genes em estágios iniciais de desenvolvimento 3. De facto, os genes são expressos Dlx na zona MGE e CGE subventricular (SVZ), em todas as células progenitoras GABAérgicos. Expressão desses genes se torna restrita a seleccionar subtipos em fases pós-mitóticas 7-9. Evidências experimentais anteriores mostraram que o elemento potenciador Dlx5 / 6 permite o direcionamento seletivo de linhagens GABAérgicas em modelos de camundongos transgênicos 2. Foi testada a utilização de um destes elementos potenciadores no contexto da expressão episómico no cérebro do rato em desenvolvimento. Nós sub clonado o elemento potenciador Dlx5 / 6 em conjunto com um promotor mínimo e a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no Bluescript (BS) plasmídeo de esqueleto (Figura 1). Nós introduzimos o plasmídeo por meio de in utero eletroporação em E15.5 para alvejar seletivamente Cr-, VIP e Re subtipos 3,8,10. A nossa técnica permite electroporação escasso, o que facilitaa reconstrução das características morfológicas de células singe. Além disso, os níveis excepcionalmente elevados de expressão de genes em neurónios GABAérgicos corticais permite estudos funcionais. Realizou-se a perda eo ganho de estudos da função utilizando vários tipo selvagem e genes dominantes negativos 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Limitações da técnica
Embora esta técnica permite a célula de análise autônoma de processos celulares, não é adequado para análise da população. Os electroporations são muito escassos com menos de mil células eletroporados por cérebro. Como consequência, a técnica não pode ser utilizada para avaliar as consequências comportamentais resultantes da manipulação genética de interneurónios CGE-derivados.
Enquanto electroporações realizadas em …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Lihong Yin para assistência técnica. NVD é um destinatário de um NARSAD Young Investigator Award e também é apoiada por doações da NIH (5 K99 MH095825-02). Pesquisa no laboratório Fishell é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e da Fundação Simons.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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