Subtypselektiva Elektroporering av kortikal Interneuroner
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Studiet av det centrala nervsystemet (CNS) mognad bygger på genetisk målinriktning av neuronala populationer. Dock har till uppgift att begränsa uttrycket av gener av intresse för specifika neuronala subtyper visat anmärkningsvärt utmanande på grund av den relativa bristen på specifika promotorelement. GABAerga intern utgör en neuronal population med omfattande genetiska och morfologiska mångfalden. I själva verket har mer än 11 olika subtyper av GABAergic interneuronen karakteriserats i musen cortex 1. Här presenterar vi ett anpassat protokoll för selektiv målinriktning av GABAergiska populationer. Vi uppnådde subtyp selektiv målinriktning av GABAerga intern med hjälp av förstärkarelementet av homeobox transkriptionsfaktorer Dlx5 och Dlx6, homologer av Drosophila distala lösa (Dll) gen 2,3, för att driva uttrycket av specifika gener genom i livmodern elektroporering.
Introduction
Merparten av kortikala GABAerga intern kommer från två gående embryonala strukturer heter de mediala och stjärt ganglieblockerande höjder (MGE och CGE respektive) 4. Parvalbumin och somatostatin uttrycka interneuronen sitt ursprung i MGE medan Calretinin (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) och Reelin (Re) som uttrycker intern kommer från CGE. Dessa Intern subtyper kan särskiljas genom deras födelsedatum. MGE härledda subtyper föds mellan embryonala dag 9,5 (E9.5) och E16.5 5,6. Däremot är CGE härledda intern födda från E12.5 genom e18.5 med sin produktion topp på E15.5 6. Den genetiska rikta denna sena födda befolkningen är dock fortfarande svårfångade.
De murina distal-minus (Dlx) generna uteslutande uttrycks i utvecklingsventrala framhjärnan 3. GABAerga intern och striatala projektions neuroner men inte kortikala pyramidala celler uttrycker Dlx1, 2,5 och 6 gener i tidiga utvecklingsstadier 3. I själva verket är de Dlx gener uttrycks i MGE och CGE subventrikulära zonen (SVZ) i alla GABAergic gångare. Uttryck av dessa gener blir begränsad till att välja subtyper vid postmitotiska stegen 7-9. Tidigare experimentella bevis visade att Dlx5 / 6 förstärkarelement möjliggör selektiv målinriktning av GABAerga härstamningar i transgena musmodeller 2. Vi testade att använda en av dessa enhancerelementen inom ramen för episomala uttryck i utvecklings mushjärna. Vi underklonades den Dlx5 / 6 förstärkarelement tillsammans med en minimal promotor och den förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) i en Bluescript (BS) ryggrad plasmiden (Figur 1). Vi introducerade plasmiden med hjälp av i livmodern elektroporering vid E15.5 att selektivt rikta Cr, VIP och Re- subtyper 3,8,10. Vår teknik möjliggör glesa elektroporering, vilket underlättaråteruppbyggnaden av morfologiska egenskaper hos singe celler. Dessutom de exceptionellt höga nivåer av genuttryck i hjärnbarken GABAerga neuroner möjliggör funktionella studier. Vi genomförde förlust och vinst på funktionsstudier med flera vildtyp och dominanta negativa gener 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEKNISKA BEGRÄNSNINGAR
Även denna teknik möjliggör cell självständig analys av cellprocesser, är det inte lämpligt för befolkningsanalys. De electroporations är mycket gles med mindre än tusen celler elektroporerade per hjärnan. Som en följd kan tekniken inte användas för att bedöma beteendemässiga konsekvenserna av genmanipulation av CGE-härledda intern.
Medan elektroporeringar utförs vid E13.5-E14.5 mål MGE-härledda subtyper är effektivite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för Lihong Yin för tekniskt stöd. NVD är mottagare av ett NARSAD Young Investigator Award och stöds också av anslag från NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell labbet stöds av National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) och Simons Foundation.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
