In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química
Summary
Este protocolo está diseñado para demostrar método de exposición de cultivos de células a productos químicos tóxicos inhalados. La exposición de diferenciada interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias proporciona un modelo único de la exposición de las vías respiratorias a los gases tóxicos tales como el cloro. En este manuscrito se describe el efecto de la exposición al cloro en las culturas de la interfaz aire-líquido de las células epiteliales y la cultura sumergida de los cardiomiocitos. In vitro sistemas de exposición permiten importantes estudios sobre el mecanismo para evaluar las vías que podrían entonces ser utilizados para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.
Abstract
Los cultivos celulares son indispensables para desarrollar y estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos, antes de su uso en modelos animales. Tenemos la capacidad única de modelar las células del epitelio de la vía aérea humana y del músculo del corazón bien diferenciadas. Esto podría ser una herramienta muy valiosa para estudiar los efectos nocivos de los productos químicos tóxicos inhalados, como el cloro, que normalmente pueden interactuar con las superficies de las células, y forman varios subproductos al reaccionar con el agua, y la limitación de sus efectos en cultivos sumergidos. Nuestro modelo utilizando cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana bien diferenciados en la interfaz aire liqiuid elude esta limitación, así como proporciona una oportunidad para evaluar los mecanismos fundamentales de la toxicidad de los potenciales químicos inhalados venenosas. Describimos una mayor pérdida de la integridad de la membrana, la liberación de caspasa y la muerte sobre químicos tóxicos inhalados, como la exposición al cloro. En este artículo, se propone métodos para modelar la exposición al cloro en el corazón de los mamíferos y de las vías respiratorias epiteliales cells en la cultura y sencillas pruebas para evaluar su efecto en estos tipos de células.
Introduction
La exposición a productos químicos tóxicos inhalados (TICs) / gases como el cloro (Cl 2) sigue siendo un problema de salud en curso en exposiciones accidentales, así como en su uso potencial como un agente de amenaza química. Aunque los pulmones son el blanco principal, órganos como el corazón y el cerebro también se ven afectados 1-3. Modelos in vivo se utilizan generalmente para las pruebas de toxicidad de las TIC, pero en los ensayos in vitro para la evaluación de la toxicidad son más simples, más rápido y más rentable. En modelos in vitro también permiten la extensa investigación de las interacciones célula-agente que pueden ser difíciles de evaluar in vivo. Tales sistemas de exposición in vitro en son raros y por otra parte, en algunos modelos convencionales donde se añaden agentes tóxicos al medio de cultivo en el que se sumergen las células, las propiedades de los agentes pueden cambiar debido a las interacciones y la unión a componentes en el medio. En tales sistemas de cultivo de células escenarios tales como la interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células primarias vías respiratorias humanas epiteliales, que aquí se proponen, que pueden estar expuestos directamente a los agentes gaseosos podrían ser prometedores.
Las células epiteliales que recubren las vías respiratorias son las primeras líneas de defensa contra sustancias químicas tóxicas inhaladas. El epitelio de la vía aérea humana forma una barrera física entre la luz y las células subyacentes en el pulmón y participa en la respuesta del pulmón. Se produce un número de citoquinas y otros agentes pro-y anti-inflamatorias, así como segrega líquido de la superficie de moco / las vías respiratorias (ASL) que cubre el epitelio. Una de las limitaciones en sumergido en sistemas de cultivo in vitro convencionales es también que la ASL y el moco que cubre la superficie epitelial se quita o se diluyen. Esto no refleja el estado fisiológico de las células epiteliales del pulmón que se exponen al aire. Por lo tanto, un ideal sistema in vitro para las pruebas de toxicidad TIC debe replicar esta arquitectura. Hay un gran interés en el desarrollo de la detección rápida métodos que predicen la toxicidad in vivo. Las células epiteliales cultivadas en el ALI diferenciar y tienen estructuras y funciones bien diferenciadas en comparación con las células cultivadas sumergidas y servir a un modelo superior de las vías respiratorias.
En este estudio, se describe el uso de la cultura-líquido interfaz aérea de las vías respiratorias humanas (traqueobronquiales) las células epiteliales para las pruebas de toxicidad por inhalación de gas venenoso y lo comparamos con un cultivo de células sumergida de los cardiomiocitos, estudiando, por lo tanto otro objetivo importante de la toxicidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tipo más común de exposición a sustancias tóxicas agudas se produce cuando se respira un producto químico venenoso en los pulmones. Estas sustancias químicas también pueden ser tomadas rápidamente en el torrente sanguíneo y pueden afectar otros órganos, como el cerebro y el corazón. Toxicidad por inhalación de diversos agentes que utilizan modelos animales son estudiados e informó ampliamente, sin embargo los mecanismos son menos conocidos. Esto es un obstáculo importante en el desarrollo de terapias ef…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por el Programa de CounterACT, Institutos Nacionales de Salud (NIH), la Oficina del Director, y el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) Número de Grant U54 ES015678 (CWW). SA también es apoyado por el Hospital de Niños Escuela de Minas de Colaboración Premio Pilot # G0100394 y el Hospital de Niños # Premio Piloto de Investigación de Colorado Institue G0100471 Colorado / Colorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
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