रैखिक प्रवर्धन मध्यस्थता पीसीआर - अज्ञात flanking डीएनए के आनुवंशिक तत्व और विशेषता का स्थानीयकरण
Summary
रैखिक प्रवर्धन की मध्यस्थता (लैम) पीसीआर जीनोम में वायरल वैक्टर को एकीकृत करने की सटीक पदों की पहचान करने के लिए विकसित की एक विधि है. तकनीक जीन थेरेपी रोगियों, आदि उपन्यास वेक्टर प्रौद्योगिकियों, टी सेल विविधता, कैंसर स्टेम सेल मॉडल, की जैव सुरक्षा में प्रतिरूप गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए बेहतर तरीका हो विकसित किया गया है
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
रैखिक प्रवर्धन पीसीआर (लैम पीसीआर) की मध्यस्थता में किसी भी मूल के ज्ञात डीएनए से सटे अज्ञात flanking डीएनए की पहचान करने और निस्र्पक की अनुमति देता है. अधिक विशेष रूप से, लैम पीसीआर मेजबान जीनोम 1,2 भीतर (है) वायरल वेक्टर एकीकरण साइटों स्थानीय बनाना करने के लिए विकसित किया गया है. रेट्रोवायरस या transposons जैसे आनुवंशिक तत्व एक (अर्द्ध) बेतरतीब ढंग से 3-6 में मेजबान जीनोम में उनके जीनोम एकीकृत. कई मामलों में यह इन वैक्टर एकीकृत वास्तव में, जहां स्थिति पता करने के लिए निर्णायक है. लैम पीसीआर बंधाव की मध्यस्थता पीसीआर 7 और इसके वेरिएंट या उलटा पीसीआर 8 जैसे वैकल्पिक तकनीकों को बेहतर साबित किया गया है. इस विधि की संवेदनशीलता और मजबूती वेक्टर जीनोम जंक्शनों और प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों की चुंबकीय चयन की प्रारंभिक preamplification से उत्पन्न होती है. उल्लेख वैकल्पिक तरीकों की तरह, लैम पीसीआर IS 9-11 की पुनर्प्राप्ति क्षमता में एक पूर्वाग्रह शुरू करने, प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग पर निर्भर करता है. इस प्रकार,IS प्रदर्शनों की सूची (integrome) का केवल एक उप एक प्रतिक्रिया में पता लगाया जा सकता है. यह पूर्वाग्रह प्रतिबंध एंजाइमों 9 के इष्टतम संयोजन का उपयोग कर किसी नमूने की समानांतर विश्लेषण से कम से कम है. हाल ही में, प्रौद्योगिकी का एक प्रकार प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग में गतिरोध उत्पन्न और एक भी प्रतिक्रिया 9,12 में एक नमूना की निष्पक्ष जीनोम चौड़ा विश्लेषण की अनुमति देता है कि लैम पीसीआर (nrLAM पीसीआर) विकसित किया गया है गैर प्रतिबंधात्मक करार दिया.
अतीत में, लैम पीसीआर प्रेरणा का रेट्रोवायरल नैदानिक जीन थेरेपी परीक्षण 13-15 में कुछ रोगियों में ल्यूकेमिया को जन्म दे रहा है की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. तब से, लैम पीसीआर की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया गया है अन्य को एकीकृत वैक्टर (lentiviral वैक्टर, transposons) और भी निष्क्रिय एडिनो से जुड़े वैक्टर (AAV) या integrase-दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर (IDLV) की तरह वैक्टर एकीकृत करने के एकीकरण पैटर्न की पहचान करने से 16 -21. लैम पीसीआर के आवेदन व्यापक प्रसार कर रहे हैं: पारंपरिकly, तकनीक का व्यापक रूप से जीन थेरेपी आया है कि रोगियों में जीन संशोधित कोशिकाओं का प्रतिरूप संरचना का अध्ययन करने के लिए या उनके एकीकरण व्यवहार 15,16,22-24 unraveling द्वारा उपन्यास वेक्टर प्रणालियों की जैव सुरक्षा का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हाल ही में, लैम पीसीआर एक IDLV फँसाने परख 25 से विशिष्टता और डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ के बंद लक्ष्य गतिविधि का निर्धारण करने में सक्षम बनाया.
इसके अलावा, लैम पीसीआर आसानी से एक जीव में समय के साथ एक transduced सेल के भाग्य का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इस आद्य ओंकोजीन के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर शमन जीनों की पहचान करने के लिए और भी hematopoiesis या कैंसर स्टेम कोशिका जीव विज्ञान 26-28 अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. लेकिन पिछले कम से कम नहीं, लैम पीसीआर मनुष्यों 29 (और अप्रकाशित डेटा) में टी सेल रिसेप्टर विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था.
प्रौद्योगिकी की आंतरिक शक्ति एकल nucleotide आर के साथ अज्ञात flanking डीएनए के लाखों निस्र्पक की अनुमति है कि गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए विधि जोड़ने से मजबूत बनाया हैपूरे जीनोम में esolution. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम कदम कदम प्रवर्धन और lentiviral वेक्टर है की पहचान करने के लिए exemplarily अज्ञात डीएनए flanking की पहचान का वर्णन. प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया oligonucleotides. किसी भी स्रोत से निकाले डीएनए या सीडीएनए लैम पीसीआर और nrLAM पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
लैम पीसीआर तकनीक एक ज्ञात डीएनए क्षेत्र पार्श्व कि अज्ञात डीएनए अनुक्रम की पहचान करने की अनुमति देता है. क्योंकि ज्ञात डीएनए अनुक्रम में विशिष्ट प्राइमरों hybridizing साथ जंक्शनों की preamplification से उत्पन्न उच्च ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
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