Udvidelse af fundament og anvendelighed af fluorescens ved Ubundet Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) ved at kortlægge de relevante principper og demonstrere dens forenelighed med et væld af fluorophores og antistofbaserede målrettede betingelser.
Fluorescens af Unbound Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) er en radiativ excitation-emission proces, der producerer øget signal og kontrastforbedring in vitro og in vivo. FUEL deler mange af de samme grundlæggende principper som Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET), endnu i høj grad adskiller sig i de acceptable arbejdsvilkår afstandene mellem selvlysende kilden og fluorescerende enhed. Mens BRET reelt er begrænset til maksimalt 2 gange Förster radius, almindeligvis mindre end 14 nm, kan BRÆNDSTOF forekomme ved afstande på op til pm eller endog cm i mangel af en optisk absorber. Her er vi udvide fundamentet og anvendeligheden af FUEL ved at gennemgå de relevante principper bag fænomenet og vise sin kompatibilitet med en bred vifte af fluorophores og fluorescerende nanopartikler. Yderligere er nytten af antistof-målrettede BRÆNDSTOF udforsket. De her viste eksempler dokumenterer, at FUEL kan anvendes til applaf tekniske data, hvor BRET ikke er muligt, fylde den rumlige tomrum, der eksisterer mellem BRET og traditionel hele dyr billeddannelse.
Den genetiske modifikation af organismer, såsom virus 1, 2, bakterier 3 eller små pattedyr 4 til enten fremkalde eller konstitutivt udtrykker bioluminescens, har været meget vellykket og bredt demonstreret 5-7. Bioluminescens, en in vivo kemiluminescerende reaktion, der involverer naturligt forekommende reagenser har den fordel at frembringe lys uden behov for en ekstern lyskilde. Som sådan, er selvlysende billedbehandling ikke lider under de almindelige ulemper ved auto-og ikke-specifikt signal fundet fra fluorescensimagografi 8. Følgelig bioluminescens har en betydelig signal-til-støj-forholdet, da enhver detekterede signal alene hidrører fra den tiltænkte kilde. Mens mange modeller har udnyttet lux operon fra Photorhabdus luminescens (maksimal emission centreret mellem 480 og 490 nm) til in vitro og in vivo-applikationer 9, dets anvendelse i små mammals har været problematisk på grund af selve karakteren af de billeddannende betingelser; pervading eksistens af optiske absorbere, såsom hæmoglobin, og scattering midler, såsom væv og knogler, i høj grad påvirker blå til gul bølgelængder 3. Udtrykket af en manipuleret ildflueluciferase (maksimal emission ved 617nm) er for nylig blevet udviklet og indarbejdet, hvilket giver et værktøj, der i høj grad overvinder optisk absorption 10, men er stadig genstand for spredning effekter.
Som reaktion herpå har der været flere forsøg til rød-skift det udsendte signal til den ønskede optiske vindue af 650-900 nm, en region i minimeres absorption og spredning ved hjælp af bioluminescens resonans energi overførsel (BRET) 11-13. Som et middel til at forbedre detekteringssignal, BRET, som bruger en bioluminescerende kilde som donor og en ekstra fluorofor som acceptor har fundet begrænset succes. Som en skelsættende eksempel på dette fænomen, "selvlysende kvantepunkter4.; (SIQDs) 14 består af modificeret Renilla reniformis luciferaser bundet til den ydre polymer-lysin lag af kommercielt tilgængelige kvantepunkter (QDs). Efter substrat desuden den resulterende bioluminescensreaktion inducerer fluorescensemission fra QDs, genererer en betydelig produktion af røde fotoner. Imidlertid har disse SIQDs begrænset anvendelighed in vivo visualisering af fysiologisk relevante begivenheder. Denne begrænsede anvendelse er sandsynligvis på grund af vanskeligheden ved at forbinde to probe til det organ, celle eller genet af interesse, da SIQDs ikke kan være genetisk kodet, og derfor ville kræve en sekundær modifikation af polymeren skallen. For at forbedre deres anvendelighed, alternative SIQDs, hvor luciferaserne er bundet direkte til selvlysende kerne, er for nylig blevet ansat 15. Opbygning off af SIQD-koncept blev en mere anvendelig BRET systemet opnås ved at knytte Cypridina luciferase til en idocyanine farvestof 16, som var i stand til specifikt at målrette tumorer i mus, mens der producerer en væsentlig rødforskydning fra 460 nm til 675 nm. At gennemgå ikke-radiativ energioverførsel, BRET følger de samme primære begrænsninger som sin fluorescerende modstykke: Der skal være en stærk spektral overlapning mellem donor emissionen og acceptor excitationsspektre og arbejdsmiljø afstanden mellem de to dele skal være på rækkefølgen af de Förster radius (5-14 nm afhængig af donor-acceptor pair, med en effektiv maksimal afstand på to gange Förster radius 17). Denne afstand afhængighed i høj grad begrænser de typer af begivenheder, der kan observeres ved hjælp BRET som et middel til at øge afsløring.
For nylig blev en ny fremgangsmåde blev identificeret og påvist under både in vitro og in vivo. Opbygning off grundlaget for BRET, Fluorescens af Unbound Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) 18, 19 </sup> kræver også en stærk spektral overlapning mellem selvlysende og fluorescerende komponenter. Men i modsætning til BRET FUEL er en helt radiative proces, hvorved den udsendte foton fra det luminescerende kilde absorberes af en optisk tilgængelig fluorofor, der efterfølgende udsender et rødforskudt foton ifølge fluoroforen kvanteudbytte. Akin til BRET kan denne tilgang også bruges til at overvinde de begrænsninger af billeddannelse i tilstedeværelse af optiske absorbere. Den resulterende røde forskydning giver en samlet stigning og specificitet i det detekterede signal på grund af en nedgang i dæmpning og en reduktion af optiske scattering virkninger. Brændstof er blevet rapporteret at forekomme mellem bioluminiscerende Escherichia coli, der udtrykker lux operonet og QDs 18, 19. Mens eksperimentelt ligner SIQDs eksisterer en fundamental forskel: i FUEL, er det ikke nødvendigt for selvlysende kilde til at være fysisk bundet til fluoroforen, som giver mulighed for genetisk kodning af det luminescerende probe. På grund af den vellykkede påvisning af brændstof mellem selvlysende bakterier og QDs, er det muligt, at denne teknik kunne anvendes til både overfladisk (hud) og dybe væv (lunge, lever) infektioner såsom Staphylococcus aureus og Klebsiellia pneumoniae.
Siden rapporten fra sin eksperimenterende betydning har FUEL udviklet sig til at omfatte en robust matematisk model 20, der kan bruges til at forudsige acceptabel selvlysende og fluorescerende par, og dens anvendelsesmuligheder er udvidet til at omfatte brug i identifikation af fotofysiske karakteristika såsom kvantumudbyttet. Vi beskriver nedenfor nogle af de grundlæggende teknikker for brændstof. Først viser vi bevis for dette fænomen over både korte (um) og lang (cm) arbejder afstande, der fundamentalt adskiller FUEL fra BRET. For det andet, vi udvide de mulige FUEL par ved at undersøge en bred vifte af fluorophores og fluorescerende nanopartikler. Omfatd, er FUEL applikationer undersøges ved at sammenligne målrettede og ikke-målrettede FUEL par.
Den grundlæggende demonstration af brændstof kan opnås blot ved at blande selvlysende bakterier med fluorescerende nanopartikler eller QDs. De to enheder skal være fysisk adskilt og forbliver over enhver effektiv RET afstand. Mere vanskeligt er FUEL signal optimering både in vitro og in vivo. Under in vitro-betingelser, både med og uden optisk absorber til stede, sædvanligvis tilsætning af overskydende fluorofor vil være tilstrækkelig til at maksimere FUEL respons. Men ved høje koncentrationer fænomener såsom statisk eller collisional quenching kan føre til et tab af fluorescerende signal. Udførelse af en fortyndingsrække ved uafhængigt at variere koncentrationen af det luminescerende kilden og fluorophoren vil bidrage til at optimere de ønskede koncentrationer. Etablering og optimering af brændstof under in vivo koncentrationer er langt vanskeligere og skal behandles på et sag til sag-basis. Det kan være vanskeligt at skabe en condition hvor fluorescerende enhed kan tilgås optisk af selvlysende kilden. Som sådan kan der begynder med direkte co-injektioner af de to grupper tilvejebringe oplysninger om succes FUEL under optimale betingelser.
Standardprotokoller findes for mærkning af bakterier og eukaryote celler med fluorescerende enheder såsom Alexa serien og QDs. Dette kræver ofte overflade funktionalisering eller aktivering med antistoffer, som kan føre til uønskede virkninger som reduceret cellelevedygtighed eller ændret metabolisk aktivitet. For at overvinde dette, er det vigtigt at bestemme den optimale mængde af antistof eller aktivering agent behov der minimerer cellulære perturbationer samtidig maksimere den fluorescerende mærkning. Anvendelsen af QDs er fordelagtig på grund af deres karakteristiske bred excitationsspektre, smalle og afstemmelige emissionsspektre, og muligheden for et stort Stokes skift. Dog kan QDs være cytotoksiske og kan ikke være ønskelig i nogle tilfælde.
<pclass = "jove_content"> FUEL er et fænomen, der er til stede i mange Bret eksperimenter 13 og gælder for en bred vifte af selvlysende og fluorescerende kilder. Indtil nu var fotonerne følger FUEL betragtes produktet af ikke-specifikke interaktioner eller en uheldig baggrund signal som følge af dårligt designet Bret eksperimenter. Det er kun med den type af eksperimenter viste her, at vi var i stand til at identificere nytten af denne uønskede signal. I de viste eksempler, luminescerende bakterier fungere som en diffus excitationskilde stand til at fremkalde en standard fluorescerende respons fra en bred vifte af fluorescerende enheder. På grund af den væsentlig bearbejdning afstand, er det sikkert at konkludere, at mens FUEL kan konstrueres uden forekomsten af BRET generelt BRET ikke kan observeres uden et bidrag fra FUEL. Vigtigere er det, på grund af manglen på en målrettet krav, kan anvendes FUEL at dække den rumlige kløften mellem BRET og conventional hele dyr imaging teknikker.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne udvide deres taknemmelighed for økonomisk støtte fra Pasteur Foundation of New York (JD, CS, CS), EU-FP7 Program "Automation" (SLS), Institut Carnot-programmet 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) og Project IMNOS (til RT, SLS), Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), European Masters in Molecular Imaging (til det), Region Ile de France-programmer MODEXA (SLS), sesam (SLS) og DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Investissement de l'Avenir infrastruktur Nationales en Biologie-Santé: Frankrig LifebioImaging (FLI) Frankrig Life Imaging (RT, SLS), Frankrig Bioimaging (JD, SLS) og Institut Pasteur, Paris. Desuden vil forfatterne gerne takke José Bengoechea og Herbert Schweizer reagenser. Desuden vil Forfatterne vil gerne takke Cindy Fevre, der genererede antistofferne.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |