Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.
Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) is een stralings excitatie-emissie proces dat verhoogde signaal en contrast verbetering produceert in vitro en in vivo. BRANDSTOF deelt veel van dezelfde uitgangspunten als Bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET), maar sterk verschilt aanvaardbare werkafstand tussen de luminescerende bron en de fluorescerende entiteit. Terwijl BRET effectief beperkt tot maximaal 2 maal de straal Förster, gewoonlijk minder dan 14 nm, kan FUEL optreden bij afstanden tot um of zelfs cm bij ontbreken van een optisch absorptiemiddel. Op het fundament en de toepasbaarheid van FUEL hier breiden we door de herziening van de relevante beginselen achter het fenomeen en demonstreren de compatibiliteit met een breed scala aan fluoroforen en fluorescerende nanodeeltjes. Verder is het nut van antilichaam gerichte FUEL onderzocht. De hier getoonde voorbeelden tonen aan dat brandstof kan worden gebruikt voor applnicatieorganisatie waar BRET niet mogelijk is, het vullen van de ruimtelijke leegte die bestaat tussen BRET en traditionele hele dier beeldvorming.
De genetische modificatie van organismen, zoals virussen 1, 2, 3 bacteriën of kleine zoogdieren 4 ofwel induceren of constitutief bioluminescentie, zeer succesvol en breed aangetoond 5-7. Bioluminescentie is een in vivo chemiluminescente reacties met natuurlijk voorkomende reagentia, heeft het voordeel om licht te produceren zonder de noodzaak van een externe lichtbron. Als zodanig is bioluminescentie beeldvorming geen last van de gemeenschappelijke nadelen van auto-en niet-specifiek signaal gevonden van fluorescentie beeldvorming 8. Bijgevolg bioluminescentie een belangrijke signaal-ruisverhouding aangezien elke gedetecteerde signaal uitsluitend afkomstig van de beoogde bron. Hoewel veel modellen de lux operon van Photorhabdus luminescens (emissiemaximum gecentreerd tussen 480 en 490 nm) in vitro en in vivo toepassingen 9 uitgebuit, zijn gebruik in kleine MammALS is problematisch vanwege de aard van de beeldvorming voorwaarden; de doordringende bestaan van optische absorptiemiddelen, zoals hemoglobine en verstrooiing middelen, zoals weefsel en bot, sterk beïnvloeden blauw naar geel golflengten 3. De expressie van een aangelegde vuurvliegluciferase (maximale emissie bij 617nm) is recent ontwikkeld en opgenomen, het verstrekken van een hulpmiddel dat sterk overwint optische absorptie 10, maar is nog steeds onderworpen aan verstrooiingseffecten.
In reactie daarop zijn er meerdere pogingen tot rood-verschuiving van het uitgezonden signaal in de gewenste optische raam van 650-900 nm, een regio geminimaliseerd absorptie en verstrooiing, met behulp van bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) 11-13 geweest. Als een instrument om signaaldetectie verbeteren, BRET, die een bioluminescerend bron gebruikt als de donor en een toegevoegde fluorofoor als de acceptor, heeft gevonden beperkt succes. Als een rudimentaire voorbeeld van dit fenomeen, "self-lichtdoorlatende quantum dots4, (SIQDs) 14 bestaan uit gemodificeerde Renilla reniformis luciferasen gebonden aan het uitwendige polymeer-lysine layer van commercieel beschikbare quantum dots (QD). Na substraat Bovendien moeten de bioluminescente reactie induceert-emissie van de QDs, genereren een aanzienlijke productie van rode fotonen. Echter, deze SIQDs toepasbaarheid beperkt tot in vivo visualisatie van fysiologisch relevante gebeurtenissen. Deze beperkte toepasbaarheid waarschijnlijk vanwege de moeilijkheid die de dubbele sonde naar het orgaan, cel of gen van belang, aangezien de SIQDs niet genetisch gecodeerd kunnen worden en daarom zou een tweede wijziging van de polymeermantel vereist. De toepassing ervan beter, alternatief SIQDs, waarbij de luciferasen rechtstreeks zijn gebonden aan de luminescerende kern, zijn onlangs toegepast 15. Voortbouwend op de SIQD concept werd een meer toepasselijke BRET systeem bereikt door het aanbrengen van Cypridina luciferase een indocyanine kleurstof 16, die specifiek kunnen richten op tumoren in muizen terwijl de productie een aanzienlijke roodverschuiving van 460 nm tot 675 nm. Om niet-stralende energieoverdracht ondergaan, BRET volgt dezelfde primaire beperkingen als de tl-tegenhanger: er moet een sterke spectrale overlap tussen de donor emissie en de acceptor excitatiespectra en de werkafstand tussen de twee groepen zijn, moeten in de orde van de Förster radius (5-14 nm afhankelijk van de donor-acceptor paren, met een effectieve maximale afstand tweemaal de Förster radius 17). Deze afstand afhankelijkheid sterk beperkt de typen gebeurtenissen die kunnen worden waargenomen met behulp BRET als middel om detectie te verbeteren.
Onlangs werd een nieuwe benadering geïdentificeerd en aangetoond onder zowel in vitro als in vivo omstandigheden. Voortbouwend op het fundament van BRET, Fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) 18, 19 </sup> vereist ook een sterke spectrale overlap tussen de luminescerende en fluorescerende componenten. In tegenstelling BRET, FUEL is een volledig radiatieve proces waarbij het uitgezonden foton uit het luminescerende bron wordt geabsorbeerd door een optisch toegankelijke fluorofoor, die vervolgens zendt een rood-verschoven foton volgens de fluorofoor quantum opbrengst. Verwant aan BRET Deze benadering kan ook worden gebruikt om de beperkingen van beeldvorming in aanwezigheid van optisch absorberende overwinnen. De verkregen rode verschuiving geeft een algemene toename en specificiteit van het gedetecteerde signaal door een afname in demping en een vermindering van optische verstrooiing effecten. FUEL is gemeld optreden tussen bioluminescentie Escherichia coli uiting van de lux operon en QD's 18, 19. Terwijl experimenteel vergelijkbaar met de SIQDs, een fundamenteel verschil bestaat: brandstof, is het niet noodzakelijk dat de luminescerende bron fysiek gebonden aan de fluorofoor, waardoor fo zijnr genetische codering van de luminescerende probe. Door de succesvolle detectie van FUEL tussen lichtgevende bacteriën en QD, is het mogelijk dat deze techniek kan worden toegepast op zowel oppervlakkige (huid) en diepe weefsels (long, lever) infecties zoals Staphylococcus aureus en Klebsiellia pneumoniae.
Sinds het verslag van de experimentele betekenis heeft FUEL ontwikkeld tot een robuust wiskundig model 20 dat kan worden gebruikt om aanvaardbare luminescentie en fluorescentie paren voorspellen bevatten en de toepassingen uitgebreid met gebruik omvatten identificatie van fotofysische eigenschappen zoals quantum opbrengst. We beschrijven hieronder een aantal van de basistechnieken van FUEL. Ten eerste, laten we zien bewijs voor dit fenomeen dan zowel de korte (micrometer) en lange (cm) werkafstanden, die fundamenteel onderscheidt brandstof uit BRET. Ten tweede, bij eventuele FUEL paren vergroten zo door behandeling van een breed scala aan fluoroforen en fluorescente nanodeeltjes. Third, worden FUEL toepassingen onderzocht door het vergelijken van gerichte en ongerichte FUEL paren.
De fundamentele demonstratie van FUEL kan eenvoudig worden bereikt door het mengen van lichtgevende bacteriën met fluorescerende nanodeeltjes of QD's. De twee entiteiten fysiek gescheiden zijn en blijven zonder enige efficiënte RET afstand. Moeilijker is de brandstof signaal optimalisatie zowel in vitro als in vivo. Onder in vitro omstandigheden, zowel met als zonder optische absorptie aanwezig, gewoonlijk de toevoeging van overmaat fluorofoor zal volstaan om de FUEL respons te maximaliseren. Bij hoge concentraties verschijnselen zoals statische of botsing quenching kan leiden tot een verlies van fluorescerend signaal. Het uitvoeren van een verdunningsreeks van onafhankelijk variëren van de concentratie van de luminescerende bron en de fluorofoor zal helpen om de gewenste concentraties te optimaliseren. De oprichting en optimalisatie van FUEL onder in vivo concentraties is veel moeilijker en moet van geval tot geval moeten worden aangepakt. Het kan moeilijk zijn om een co creërenndition waar de fluorescerende entiteit kan optisch worden benaderd door de lichtgevende bron. Als zodanig, te beginnen met directe co-injecties van de twee groepen kan informatie met betrekking tot het succes van FUEL onder optimale omstandigheden.
Standaard protocollen bestaan voor het labelen van bacteriën en eukaryote cellen met fluorescerende entiteiten zoals de Alexa-serie en QD's. Vaak moet oppervlak functionalisering of activering met antilichamen, wat kan leiden tot ongewenste effecten zoals verminderde cellevensvatbaarheid of gewijzigde metabolische activiteit. Om dit te overwinnen, is het belangrijk om te bepalen van de optimale hoeveelheid antilichaam of activatie agens nodig die cellulaire minimaliseert verstoringen tegelijkertijd de fluorescente labeling. Het gebruik van QDs is voordelig vanwege hun kenmerkende brede excitatiespectra, smal en afstembare emissiespectra en de mogelijkheid van een grote Stokes verschuiving. Echter, QDs cytotoxisch en niet gewenst zijn in sommige gevallen.
<pclass = "jove_content"> FUEL is een verschijnsel dat in veel BRET experimenten 13 is en is toepasbaar op een verscheidenheid van luminescentie en fluorescerende bronnen. Tot nu toe werden de fotonen gevolg van BRANDSTOF als het product van niet-specifieke interacties of een ongelukkige achtergrondsignaal gevolg van slecht ontworpen BRET experimenten. Het is alleen met de aard van de experimenten hier laten zien dat we in staat waren om het nut van deze ongewenst signaal te identificeren. In de getoonde voorbeelden, de lichtgevende bacteriën fungeren als een diffuse excitatiebron staat tot het opwekken van een standaard fluorescente reactie van een grote verscheidenheid van fluorescente eenheden. Bovendien, als gevolg van de aanzienlijke werkafstand, is het veilig om te concluderen dat terwijl FUEL kan worden gebouwd zonder het optreden van Bret in het algemeen BRET kan niet worden waargenomen zonder een bijdrage van FUEL. Belangrijk is door het ontbreken van een targeting vereiste brandstof worden gebruikt om de ruimtelijke kloof tussen BRET en Conventional hele dier beeldvormende technieken.The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag hun dankbaarheid voor financiële ondersteuning uit het Pasteur Stichting van New York uit te breiden (JD, CS, CS), de EU-FP7 programma "Automation" (SLS), het Institut Carnot Programma 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) en Project IMNOS (RT, SLS), de Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), de European Masters in Molecular Imaging (IT), het programma Regio Ile de France MODEXA (SLS), SESAM (SLS) en DimMalInf (SLS, RT), de ANR Programma Grandes Investissement de l'avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Sante: Frankrijk LifebioImaging (FLI) Frankrijk Life Imaging (RT, SLS), Frankrijk Bioimaging (JD, SLS) en de Institut Pasteur, Parijs. Verder zou de auteurs willen bedanken, Jose Bengoechea en Herbert Schweizer voor reagentia. Verder zou De auteurs willen Cindy Fevre die de antilichamen gegenereerd bedanken.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |