De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Summary

Este documento detalla cómo Elvax 40W se puede utilizar como un método de liberación lenta para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. El protocolo para la preparación, carga, y entrega el complejo fármaco-resina para el ojo se describe.

Abstract

Enfermedades de la retina son difíciles de tratar como la retina se encuentra profundamente dentro del ojo. Los métodos invasivos de administración de fármacos a menudo son necesarios para el tratamiento de estas enfermedades. Enfermedades de retina crónico tales como edema retinal o la neovascularización por lo general requieren múltiples inyecciones intraoculares para tratar eficazmente la enfermedad. Sin embargo, los riesgos asociados con estas inyecciones aumentan con la entrega repetida de la droga. Por lo tanto, los métodos de entrega alternativos necesitan ser establecidos con el fin de minimizar los riesgos de reinyección. Varias otras investigaciones han desarrollado métodos para administrar fármacos a través del tiempo extendido, a través de materiales capaces de liberar sustancias químicas lentamente en el ojo. En esta investigación, se describe el uso de Elvax 40W, una resina de copolímero, para actuar como un vehículo para la administración de fármacos a la retina de rata adulta. La resina se hace y se carga con el fármaco. El complejo fármaco-resina se implanta en la cavidad vítrea, en donde será liberar el fármaco lentamente sobre timí. Este método fue probado usando 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), un análogo de glutamato que bloquea la luz de respuesta de la retina. Se demostró que la APB se libera lentamente de la resina, y fue capaz de bloquear la respuesta de la retina por 7 días después de la implantación. Esto indica que la administración de fármacos de liberación lenta usando esta resina de copolímero es eficaz para el tratamiento de la retina, y podría ser utilizado terapéuticamente con más pruebas.

Introduction

El tratamiento de enfermedades crónicas como la diabetes y la hipertensión arterial presenta muchos desafíos, ya que estas enfermedades generalmente requieren tratamiento durante largos períodos de tiempo, a menudo de por vida. Esto ha llamado para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos de liberación lenta, que reducen la necesidad de una dosificación frecuente. La eficacia de estos métodos de liberación lenta se ha demostrado mediante el desarrollo de bombas de insulina, para reducir el número de inyecciones de insulina necesarias para tratar la diabetes. Las enfermedades crónicas de los ojos, sobre todo los que afectan a sus capas internas, requieren la administración frecuente de medicamentos a través de procedimientos invasivos. Una enfermedad crónica que afecta tal que el ojo humano es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Afecta a la retina central, que es una capa de tejido neural situado en la parte posterior del ojo responsable de iniciar la visión. AMD es la principal causa de ceguera en el mundo occidental ^1. Un desafío particular con el tratamiento de reenfermedades intes- es que el medicamento es necesario para llegar a esta capa profunda en el ojo, que a menudo requiere de métodos invasivos de entrega. Los fármacos se administran habitualmente a la cámara vítrea y la retina utilizando inyecciones intravítreas. Sin embargo, con cada inyección hay un riesgo de complicaciones postinyección, incluyendo endoftalmitis, desprendimiento de retina, cataratas y hemorragia del vítreo ^2. Este riesgo se multiplica con cada reinyección de la droga.

La reducción de la necesidad de múltiples inyecciones sería un beneficio importante en el tratamiento de la AMD. Para tratar la forma húmeda de AMD, donde el nuevo crecimiento de los vasos es un sello distintivo, la estrategia terapéutica establecida es apuntar a los factores de crecimiento endotelial (VEGF) que utilizan inhibidores del VEGF ^3. En la actualidad, éstos se entregan a través de inyecciones intravítreas repetidas. Del mismo modo, en el tratamiento de edema macular, una complicación común de la retinopatía diabética, los corticosteroides se entregan a través de inyecciones repetidas <shasta> 4. La entrega de estos medicamentos a través de métodos de liberación lenta de hecho podría reducir el riesgo de complicaciones inyección.

La noción de un sistema de administración de fármacos de liberación lenta se describió primero usando un vehículo de caucho de silicona para entregar pequeñas moléculas en los tejidos animales ^5. Desde entonces, otros métodos de liberación lenta se han desarrollado para proporcionar moléculas más grandes, varios de los cuales han sido probados en el ojo. Portadores de partículas, tales como microesferas biodegradables, poli-lactida-co-glicolida (PLGA) nanopartículas y vesículas de fosfolípidos (liposomas) pueden ser útiles como vehículos de administración ^6,7. Nanopartículas y liposomas de PLGA se han comparado en un entorno in vitro por su capacidad para suministrar agentes anti-cáncer a través de la esclerótica en el tiempo ^7. Ambos vehículos fueron efectivos en la liberación de los fármacos lentamente. Sin embargo, el estudio sólo se llevó a cabo en un entorno in vitro. BOCHOT et al. (2002) ⁸ probadosla eficacia de los liposomas para entregar moléculas a la retina in vivo. Ellos han demostrado que los liposomas entregar con éxito pequeños oligonucleótidos a la retina de conejo. Los autores sugirieron que los liposomas podrían ser beneficiosos en el tratamiento de enfermedades de la retina ^8. Sin embargo, la naturaleza de estas vesículas para flotar en el humor vítreo significa que es probable que difuminar o poner en peligro la visión ^9.

Okabe et al. (2003) ¹⁰ no utilizan discos de polímero biodegradable compuesta por 33% de acetato de etileno-vinilo para aplicar beta-metasona en conejos. Se implantaron los discos en un bolsillo escleral y demostraron la liberación eficaz del fármaco en el humor vítreo y la retina de hasta un mes ^10. Sin embargo, en este protocolo particular, el implante fue relativamente grandes y rígidos, y requiere un procedimiento quirúrgico más complejo que incluye una gran incisión escleral y la sutura.

Un estudio anterior investigó el tissue respuesta a diversos vehículos de polímero por implantarlos en la córnea de los ojos del conejo, y se encontró que los copolímeros de acetato de etileno-vinilo lavadas en alcohol no causan inflamación o irritación. Estos complejos se muestran para sostener el suministro de compuestos más grandes en los tejidos animales durante largos períodos de tiempo, algunos superior hasta 100 días dependiente de la droga ^11. Uno de tales tipos de resina de copolímero se ha desarrollado industrialmente en forma de Elvax 40W (40% en peso de etileno-acetato de vinilo contenido de comonómero con un aditivo de amida de "W" para mejorar el manejo de pellets). Esta resina de copolímero es una sustancia inerte que es estable tanto a temperatura ambiente y corporal. No se ha demostrado que causa alergia o toxicidad en el tejido biológico. Esta resina efectivamente ha entregado una gran variedad de drogas en diferentes modelos experimentales que investigan las funciones de varios sistemas, como el sistema ductal mamaria ^12, la corteza auditiva primaria ^{13,14 <}/ Sup>, y el sistema visual ¹⁵ rana. Esta resina también se ha utilizado en el ojo para suministrar fármacos para el desarrollo de tortuga ^{16,17, 18,19} embrión de pollo, y hurón adulto retinas ^20. En el sistema nervioso central de la rata, la resina sólo se ha utilizado en el cerebro ^21-23, pero su uso en el ojo de la rata no se ha documentado.

Las ventajas del uso de esta resina de copolímero para suministrar fármacos lentamente a la retina con respecto a otros métodos, es que es un compuesto estable que no causa inflamación o irritación en el ojo. A diferencia de los portadores de partículas, el complejo fármaco-resina no perjudicar la visión después de la implantación, ya que normalmente permanece en el sitio de la entrega en lugar de flotar en el humor vítreo. Sólo se requeriría un proceso de implantación sencilla en la cavidad vítrea cerca del limbo del ojo, y no requeriría la sutura después de la implantación. Recientemente, ha habido un surgimiento en varios nuevos sistemas de suministro, tales comola tecnología de células encapsuladas (ECT) ^24,25, hidrogeles ²⁶ y ²⁷ microfilms. Sin embargo, el método utilizado en el estudio actual para preparar y entregar el complejo fármaco-resina es a la vez fácil de seguir y de bajo costo, siendo por tanto más ventajoso para su uso en un entorno de investigación básica. El reto de la utilización de este complejo para ofrecer tratamientos farmacológicos a largo plazo es determinar la concentración óptima de la droga que va a maximizar los beneficios terapéuticos de tener un menor número de inyecciones intravítreas.

Este trabajo tiene como objetivo demostrar el uso del complejo fármaco-resina para el tratamiento a largo plazo de la retina de rata adulta. La eficacia de este modo de entrega se prueba utilizando el análogo de glutamato 2-amino-4-fosfonobutirato (APB) que el medicamento. APB bloquea la respuesta a la luz de las células bipolares ON imitando el glutamato, un neurotransmisor endógeno en la retina ^28. Cuando APB compite con glutamato por su receptor, bloquea el light respuesta. APB se ha utilizado en estudios fisiológicos para controlar la función de la retina y medir su efecto usando métodos electrofisiológicos como el electrorretinograma (ERG). En estudios anteriores, APB se ha utilizado durante tanto a corto plazo ²⁹ y el tratamiento a largo plazo de la retina en desarrollo; En ella se registra dar una dosis única vía inyección intraocular al día durante ³⁰ días 30. La misma cantidad de APB (0,092 mg en solución salina estéril, a una concentración de 50 mM) se utilizó para todas las inyecciones como se sugiere en el trabajo anterior ^28,29,31. Elegimos APB para poner a prueba el complejo fármaco-resina como un vehículo de liberación lenta para administrar fármacos en el ojo. Los métodos descritos en este estudio son similares a los métodos descritos anteriormente que implican la preparación de la droga-resina compleja ^16,32; Sin embargo, también detalle su uso específicamente en el ojo de rata adulta. Después de la implantación quirúrgica de la resina cargada-APB en el ojo, ERG se realizó para determinar si APB suprime la rrespuesta a la luz etinal, y por lo tanto si APB ha sido lanzado con éxito en el humor vítreo y la retina.

Protocol

Todos los experimentos realizados fueron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y con la aprobación de la Universidad de Comité de Ética Animal de L'Aquila y al Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Australia. Las ratas adultas (P100-200) se utilizan en todo este estudio. 1. Preparar los gránulos de resina de copolímero Coloque 20 pastillas Elvax 40W en un pequeño vaso de vidrio en…

Representative Results

Electrorretinograma de campo completo (ERG) se utilizó para detectar el efecto de APB en la retina. Para más detalles sobre cómo se realizó el ERG, consulte los siguientes estudios 33,34. En resumen, después de anestesiar al animal, un electrodo de oro fue colocado en la córnea del ojo, y el electrodo de referencia se colocó en el cuero cabelludo anterior entre los ojos, para registrar la actividad eléctrica de la retina. Los estímulos se generaron utilizando una unidad de flash electrónico y la int…

Discussion

Este trabajo demostró el uso de un complejo de fármaco-resina para el suministro de liberación lenta de fármacos a la retina. El objetivo de presentar un método que es relativamente barato y fácil de aplicar en un modelo de pequeños animales.

Dado que la función de APB es actuar como un análogo de glutamato, bloqueará la respuesta de la retina en el ojo. Los resultados muestran que APB provocó el bloqueo de la respuesta de la retina en una semana después de la implantación. Esto…

Materials

Elvax 40W Pellets	Du Pont, DE, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	A1910
Dichloromethane	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	34856
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
Drierite, calcium sulfate	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	238910
Ketamine, Ilium Ketamil	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Xylazine, Ilium Xylazil-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Atropine Sulphate, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Tetracaine Hydrochloride, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Chloramphenicol, Chlorsig ointment	Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
Pentobarbital, Lethabarb	Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
Lignocaine Hydrochloride, Ilium Lignocaine-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Uni-Core Punch Tool	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Curved Forceps	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Operating Microscope, Zeiss OPMI 99	Zeiss, West Germany
25G Insulin Needle	Terumo Corp., Tokyo, Japan
Dumont Tweezers	World Precision Instruments Inc., FL, USA