포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
헴은 헤모글로빈, 미오글로빈 및 사이토 크롬 등 hemoproteins로 알려진 단백질의 광범위한 보철 기로서 기능한다. 그것은 같은 유전자 전사, 번역, 세포 분화 및 세포 증식 등의 다양한 분자와 세포 과정에 참여하고있다. 헴 생합성 레벨이 다른 조직과 세포 유형에 걸쳐 다양하며, 빈혈, 신경 장애 및 암과 같은 질병 상태로 변경된다. 이 기술을 사용하여 [4- (14) C] 5- 아미노 레 불린 산 ([14 C] 5-ALA), 포유류 세포에서 헴 합성의 수준을 측정하는 헴 생합성 경로에서 초기 전구체 중 하나. 이 분석은 헴에 혼입 된 방사능의 측정 및 헴 추출하여 [14 C] 5-ALA를 가진 세포의 배양을 수반한다. 이 절차는 정확하고 신속하다. 이 방법은 헴 생합성의 상대적인 수준보다는 헴 총 함량을 측정한다. 이 TECHN의 사용을 설명하기 위해헴 생합성 수준 개새끼 것은 여러 포유 동물 세포주에서 측정 하였다.
Introduction
헴은 철 철과 프로토 포르피린 IX의 복잡한 수송 및 거의 모든 살아있는 유기체 1-3에 산소를 이용하기위한 중앙 분자이다. 헴의 독특한 구조는 이원자 가스 및 전자의 캐리어로서 기능 할뿐만 아니라, 다양한 다른 기능 1-5을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 헴 산소 -6,7-의 전송 및 저장을 위해 미오글로빈 헤모글로빈의 산소에 결합한다. 또한, 호흡시에 시토크롬 전자 캐리어로 작동과 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매 8,9 산화 환원 반응에서 전자 공여체로서 작용한다. 헴의 가장 중요한 특징 중 하나는 이러한 유전자 전사, 단백질 합성 및 마이크로 RNA의 생합성과 같은 4 세포 및 분자 공정에서 규제 역할을 할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 포유류의 전사 리프레 Bach1의 활성 및 포유류 핵 REC를 제어함으로써 많은 유전자의 전사에 영향을 미치는eptor 목사 erbα 10 ~ 15. 헴 헴 또는 산소 (16)에 응답하여, 호흡 및 산화 적 손상의 제어에 관여하는 유전자의 활성화에 중요한 역할을 헴 활성제 단백질 HAP (1)의 작동을 조절한다. 헴 또한 3,17-20 시그널링 신경 성장 인자 (NGF)를 통한 신경 세포에서의 유전자 전사를 조절한다. 또한 헴 조절 eIF2α 키나아제 (HRI) 21-24의 활성을 조절함으로써 포유류 적혈구 세포에서 단백질 합성을 조절한다. 또한, 헴 적절한 세포 기능 및 세포 증식 4,20,25에 필수적인 티로신 키나제의 Src 릴화 Jak2과 같은 주요 신호 전달 단백질의 활성에 영향을 미친다. 그것은 헬라 세포의 헴 억제 노화 및 세포 사멸 (26)과 관련된 마커의 세포주기 정지 및 활성화가 발생하였습니다. 헴 결핍 또는 헴의 증가 수준은 모두 인간 27 심각한 건강에 미치는 영향과 관련이있다. 최근 분자ND 역학 연구는 높은 헴 섭취 양 협회 및 2 형 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 폐암, 대장 암, 췌장암 27,28 등 여러 암과 같은 질병의 위험 증가를 보여 주었다. 정상 및 폐 암 세포 저자 '랩의 짝을 사용하는 것이 암세포 산소 소비, 헴 합성 및 헴 흡수 및 산소 이용률 28에 관여하는 단백질의 수준이 증가 된 것을 발견 하였다. 흥미롭게도, 헴 합성의 억제는 산소 소비, 증식, 암 세포 (28)의 이동과 콜로니 형성을 감소시켰다. 따라서, 내인성 헴의 레벨 변동이 분자 세포 프로세스 3,4,28,29의 조절에 중요한 역할을한다.
포유 동물에서, 헴의 생합성은 미토콘드리아와 세포질 4 (그림 1)에있는 효소를 포함, 여덟 단계에서 발생합니다. 헴 biosyn논문 ALA 신타 (아아) 4,31 의해 촉매 5- 아미노 레 불린 산 (5-ALA)을 형성 글리신 및 숙시 닐 -CoA의 응축과 미토콘드리아의 행렬에서 시작된다. 이것은 nonerythroid 세포에서 헴 생합성에서 속도 제한 단계이다. 5-ALA는 다음 다음 4 단계를 다시는 프로토 포르피린 IX (PPIX)로 변환되어 미토콘드리아로 가져 코프로 포르 피리 노겐 III (CPgenIII)를 형성하기 위해 발생하는 세포질에 밖으로 내 보냅니다. 마지막으로, 철의 한 분자는 헴, 페로 (FECH) 1,2,4에 의해 촉매 반응을 생성하기 위해 프로토 포르피린 IX (PPIX)에 통합된다.
헴 생합성의 레벨은 주로 세포 단단히 철 및 헴 (4)에 의해 제어된다 아아 효소의 수준에 따라 달라진다. 헴 생합성 유전자 결함은 특정 미네랄과 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 아연), 독소 (예를 들어, 알루미늄, 납 노출의 가용성에 의해 영향을받을 수있다), 특정 스테로이드 (의 산소 결핍, 발열 및 레벨 예를 들어, 에스트로겐) 32 ~ 35. 헴 합성의 수준은 다양한 질환 상태에 변경된다. 감소 헴 생합성 빈혈뿐만 아니라 신경 질환 3,36의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 증가 된 헴 생합성은 특정 암 28,37의 진행에 중요한 역할을한다. 헴은 포유 동물의 지방, 적혈구와 신경 세포 4,38-41의 성장, 분화 및 생존에 중요한 것으로 나타났다. 예를 들어, 헴의 결핍은 글루타민산 NMDA (N- 메틸 – 디 – 아스파 테이트) 수용체 (17)의 억제를 통해 기본 마우스 대뇌 피질의 신경 세포의 신경 돌기의 손상으로 이어집니다. 또한 헴 합성의 억제는 인간 경부 상피 암종 HeLa 세포 26,41 프로그래밍 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 다른 조건에서 다양한 세포에서 헴 생합성 수준을 측정하는 단계와 progressi 병인 연구에 중요많은 질병의에.
여기에서는 [4- (14) C] 5- 레 블루 닉 산을 사용하여 세포 내 헴 합성의 수준을 측정하기 위해 빠르고 민감한 방법을 설명한다. 이것은 55의 Fe 또는 59의 Fe를 사용하는 다른 방법과 다른 방법이다. 그 방사선이 매우 약한 때문에 우리는 14 C를 사용하여 선호합니다. 반면, 강력한 보호는 철 동위 원소와 협력이 필요합니다. 또한,이 방법은 측정하고 빠른 방식으로 병렬로 서로 다른 셀에서 헴 합성을 비교하기위한 것이다. 헴 절대 수준을 측정하기 위하여, 하나는 HPLC 42,43의 사용을 포함하는 이전에 확립 된 방법을 사용할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
헴은 호흡 (26)를 통해 세포 에너지의 생성에 중요한 역할을한다. 변경된 헴 대사 암 28,41 포함한 다양한 질환과 관련이있는 것으로 알려져있다. 헴 합성의 억제는 HeLa 세포 26,41 세포주기 정지 및 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 높은 헴 합성 수준 폐암 세포 (28)의 진행과 연관되어 있음을 보여왔다. 따라서, 다른 조건 하에서 세포에서 헴 생합성의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HCC4017 및 HBEC30KT 세포주 친절 닥터 존 민나의 실험실에 의해 제공되었다. 이 작품은 닥터 리 장에 세실 H.와 아이다 녹색 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
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