Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Summary

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Abstract

Heme sert de groupe prosthétique pour une grande variété de protéines connues comme les hémoprotéines telles que l'hémoglobine, la myoglobine et cytochromes. Elle est impliquée dans divers processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription génique, la traduction, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire. Les niveaux de la biosynthèse de l'hème varient selon les différents tissus et types de cellules et est altérée dans des conditions pathologiques telles que l'anémie, la neuropathie et le cancer. Cette technique utilise [4- ¹⁴ C] de l'acide 5-aminolévulinique ^([14 C] 5-ALA), l'un des premiers précurseurs de la voie de biosynthèse de l'hème pour mesurer les niveaux de synthèse de l'hème dans les cellules de mammifères. Ce test implique l'incubation des cellules avec ^[14 C] 5-ALA suivie d'une extraction de l'hème et de la mesure de la radioactivité incorporée dans l'hème. Cette procédure est précise et rapide. Cette méthode permet de mesurer les niveaux relatifs de biosynthèse de l'hème, plutôt que la teneur totale de l'hème. Pour démontrer l'utilisation de ce technIQUE les niveaux de biosynthèse de l'hème ont été mesurés dans plusieurs lignées de cellules de mammifères.

Introduction

L'hème, un complexe de fer ferreux et la protoporphyrine IX est une molécule central pour le transport et l'utilisation de l'oxygène dans pratiquement tous les organismes vivants ^1-3. La structure unique de l'hème lui permet de fonctionner en tant que transporteur de gaz et des électrons diatomiques, ainsi que pour effectuer diverses autres fonctions ^1-5. Par exemple, l'hème se lie à l'oxygène de l'hémoglobine et de la myoglobine pour le transfert et le stockage de ^6,7 à oxygène. Il fonctionne aussi comme un porteur d'électrons dans les cytochromes pendant la respiration et agit comme un donneur d'électrons pour des réactions catalysées par des enzymes d'oxydo-réduction du cytochrome P450 ^8,9. L'une des caractéristiques les plus importantes de l'hème est que, il peut jouer un rôle de régulation dans les processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription des gènes, la synthèse des protéines et de micro-ARN biogenèse ^4. Par exemple, elle affecte la transcription de nombreux gènes en contrôlant l'activité de répresseur de la transcription de mammifère et la rec Bach1 nucléaire mammifèreeptor Rev-erbα ^10-15. L'hème régule l'activation de la protéine activatrice de l'hème (Hap) 1 qui joue un rôle important dans l'activation de gènes impliqués dans la respiration et de contrôle des dommages oxydatifs, en réponse à l'hème ou de l'oxygène ^16. Heme réglemente également la transcription des gènes dans les cellules neuronales par le facteur de croissance des nerfs (NGF) de signalisation ^3,17-20. Elle régule également la synthèse des protéines dans les cellules érythroïdes de mammifère en modulant l'activité de l'hème-kinase régulée eIF2α (HRI) ^21-24. En outre, l'hème affecte l'activité de protéines de signalisation clés tels que la tyrosine kinase Src et Jak2, qui sont essentiels pour le fonctionnement des cellules et ^4,20,25 de la croissance cellulaire. On a constaté que dans les cellules HeLa inhibition de l'hème provoque l'arrêt du cycle cellulaire et l'activation des marqueurs associés à la sénescence et l'apoptose ^26. Les deux Heme carence ou des niveaux accrus de l'hème sont associés à des effets graves sur la santé chez les humains ^27. Une moléculaire récentend études épidémiologiques ont montré une association positive de l'apport élevé en hème et un risque accru de maladies, comme le diabète de type 2, les maladies coronariennes et plusieurs cancers dont le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer du pancréas ^27,28. Utilisation d'une paire appariée de laboratoire cellules pulmonaires normales et cancéreuses auteurs ont constaté que les cellules cancéreuses ont augmenté les niveaux de consommation d'oxygène, la synthèse de l'hème et des protéines impliquées dans l'absorption de l'hème et de l'oxygène ²⁸ utilisation. Chose intéressante, l'inhibition de la synthèse de l'hème diminution de la consommation d'oxygène, la prolifération, la migration et la formation des colonies de cellules ²⁸ cancéreuses. Ainsi, la fluctuation des niveaux d'hème endogène joue un rôle important dans la régulation des processus moléculaires et cellulaires ^3,4,28,29.

Chez les mammifères, la biosynthèse de l'hème se produit en huit étapes, faisant intervenir des enzymes situées dans les mitochondries et le cytosol ⁴ (figure 1). Heme biosynthèse commence dans la matrice de la mitochondrie avec la condensation de glycine et de succinyl-CoA pour former l'acide 5-aminolévulinique (5-ALA), catalysée par ALA synthase (ALAS) ^4,31. Ceci est le taux étape de biosynthèse de l'hème dans les cellules nonerythroid limitant. 5-ALA est ensuite exporté vers le cytosol où les quatre étapes suivantes se produisent pour former coproporphyrinogène III (CPgenIII), qui est ensuite importé retour à la mitochondrie, où il est transformé en protoporphyrine IX (PpIX). Enfin, une molécule de fer est incorporé à la protoporphyrine IX (PpIX) pour produire de l'hème, une réaction catalysée par ferrochélatase (FECH) ^2,4.

Le niveau de biosynthèse de l'hème dépend principalement sur ​​le niveau de ALAS enzyme qui est étroitement contrôlée par le fer intracellulaire et ⁴ de l'hème. La biosynthèse de l'hème peut être affectée par des défauts génétiques, la disponibilité de certains minéraux et des vitamines (par exemple, la riboflavine, zinc), l'exposition à des toxines (par exemple, l'aluminium, le plomb), Anoxie, de la fièvre, et des niveaux de certains stéroïdes (par exemple, l'œstrogène) ^32-35. Le niveau de synthèse de l'hème est modifié dans diverses conditions pathologiques. Diminution de la biosynthèse de l'hème peut causer l'anémie ainsi que les maladies neurologiques ^3,36. En variante, l'augmentation de la biosynthèse de l'hème joue un rôle important dans la progression de certains cancers ^28,37. L'hème a été montré pour être critique pour la croissance, la différenciation et la survie du tissu adipeux chez les mammifères, érythroïde et des cellules neuronales ^4,38-41. Par exemple, une déficience de l'hème conduit à des lésions des neurites dans des neurones corticaux primaires de souris via l'inhibition de glutamate NMDA (N-méthyl-D-aspartate) ¹⁷ récepteur. En outre, l'inhibition de la synthèse de l'hème entraîne la mort cellulaire programmée dans le col épithéliale carcinome des cellules humaines HeLa ^26,41. Par conséquent, en mesurant les niveaux de la biosynthèse de l'hème dans diverses cellules dans des conditions différentes est important pour l'étude de l'étiologie et progressisur de nombreuses maladies.

Nous décrivons ici une méthode rapide et sensible pour mesurer le niveau de synthèse de l'hème intracellulaire en utilisant [4- ¹⁴ C] acide 5-aminolevulic. Ceci est une méthode alternative à d'autres méthodes utilisant ⁵⁵ Fe ou ⁵⁹ Fe. Nous préférons utiliser ¹⁴ C parce que son rayonnement est très faible. En revanche, une forte protection est nécessaire pour travailler avec des isotopes Fe. En outre, cette méthode vise à mesurer et comparer la synthèse de l'hème dans des cellules différentes en parallèle d'une manière rapide. Afin de mesurer les niveaux de l'hème absolus, on peut utiliser la méthode précédemment établi impliquant l'utilisation de HPLC ^42,43.

Protocol

ATTENTION: Tout en travaillant avec la radioactivité, prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l'expérimentateur et les environs. Éliminer tous les déchets hors suivant les directives de sécurité de rayonnement locales. 1. Préparation des cellules cellules de semences à 3,5 cm plaques telles que la confluence atteint 80% -90% sur le jour de l'analyse. A noter que pour le semis de confluence des cellules dépend du type de cell…

Representative Results

Cette méthode a été utilisée pour comparer les niveaux de synthèse de l'hème dans la normale (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) les cellules pulmonaires. La figure 2 montre un niveau plus élevé de la synthèse de l'hème dans les cellules cancéreuses (de HCC4017) que les cellules pulmonaires normales (HBEC30KT). Le niveau de synthèse de l'hème a également été mesurée dans les cellules normales et cancéreuses en présence de cyanure de carbonyle découpleur 3-chlorophénylhydrazo…

Discussion

Heme joue un rôle clé dans la génération d'énergie par la respiration cellulaire ^26. Altered métabolisme de l'hème est connue pour être associée à diverses maladies y compris le cancer ^28,41. L'inhibition de la synthèse de l'hème est connu pour provoquer un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans des cellules Hela ^26,41. Il a été démontré que le niveau de synthèse de l'hème élevée est associée à la progression de cellules de cancer du p…

Materials

Acetone	Sigma	650501
Diethy ether	Sigma	296082
HCl (Hydrochloric acid)	Fisher	A481-212
Liquid Scintillation cocktail	MP Biomedicals	882470
Trypan blue	Gibco	15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid	Perkin-Elmer life sciences		Store @  -80 °C
CelLytic M	Sigma	C2978	Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Specific reagent
	Component	Dispense
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)	Acetone	25ml
	Concentrated HCl	1.3ml
	Water	5ml