Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Summary

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Abstract

Heme tjener som protese gruppe for en rekke forskjellige proteiner kjent som hemoproteins, slik som hemoglobin, myoglobin og cytokrom. Det er involvert i ulike molekylære og cellulære prosesser som genet transkripsjon, translasjon, celledifferensiering og celleproliferasjon. Biosyntesen nivåene av heme varierer på tvers av forskjellige vev og celletyper og er endret i syke tilstander som anemi, neuropati og kreft. Denne teknikken bruker [4- ¹⁴ C] 5-aminolevulinsyre ^([14C] 5-ALA), en av de tidlige forløpere i heme biosyntesebanen å måle nivåene av heme syntese i pattedyrceller. Denne analysen innebærer inkubasjon av cellene med ^[14C] 5-ALA, etterfulgt av ekstraksjon av heme og måling av radioaktiviteten inkorporert i heme. Denne prosedyren er nøyaktig og rask. Denne fremgangsmåten måler den relative nivåer av heme biosyntese i stedet for den totale heme-innhold. For å demonstrere bruken av dette technik nivåene av heme biosyntese ble målt på flere pattedyrcellelinjer.

Introduction

Heme, et kompleks av toverdig jern og protoporfyrin IX er et sentralt molekyl for transport og anvendelse av oksygen i praktisk talt alle levende organismer ^1-3. Den unike strukturen av heme gjør det mulig å virke som en bærer av diatomiske gasser og elektroner, samt for å utføre andre funksjoner ^1-5. For eksempel, bindes heme til oksygen i hemoglobin og myoglobin for overføring og lagring av oksygen ^6,7. Det fungerer også som en elektronbærer i cytochromes under respirasjon og fungerer som et elektron donor for redoksreaksjoner katalysert av cytokrom P450-enzymer ^8,9. En av de mest betydningsfulle trekk ved heme er at den kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære prosesser som gentranskripsjon, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese ^4. For eksempel, det påvirker transkripsjonen av mange gener ved å kontrollere aktiviteten av pattedyr transcriptional repressor bach1 og pattedyratom receptor Rev-erbα ^10-15. Heme regulerer aktiveringen av heme aktivator protein (Hap) 1, som spiller en viktig rolle i aktivering av gener som er involvert i kontroll av respirasjon og oksidativ skade, i respons til heme eller oksygen ^16. Heme også regulerer gentranskripsjon i nerveceller via nervevekstfaktor (NGF) signal ^3,17-20. Den regulerer også proteinsyntese i pattedyr erytroide celler ved å modulere aktiviteten av heme-regulert eIF2α kinase (HRI) ^21-24. Videre påvirker heme aktiviteten av nøkkelsignaleringsproteiner som tyrosinkinase JAK2 og Src, som er avgjørende for riktig funksjon og celle-cellevekst ^4,20,25. Det ble funnet at i HeLa-celler heme inhibering fører til cellesyklus-stans og aktivering av markører assosiert med begynnende alderdom og apoptose ^26. Både Heme mangel eller økte nivåer av heme er forbundet med alvorlige helseeffekter hos mennesker ^27. Nyere molekylære ennd epidemiologiske studier har vist en positiv sammenheng med høy heme inntak og økt risiko for sykdommer, som type-2 diabetes, hjerte- og karsykdommer og flere krefttyper, inkludert lungekreft, tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft ^27,28. Ved hjelp av en matchet par normale og kreftlungeceller forfatternes lab har funnet ut at kreftceller har økt nivå av oksygenforbruk, heme syntese og proteiner involvert i heme opptak og oksygen utnyttelse ^28. Interessant, inhibering av heme syntese redusert oksygenforbruk, proliferasjon, migrering og kolonidannelse av kreftceller ^28. Dermed blir svingninger i nivåene av endogent heme spiller en viktig rolle i reguleringen av molekylære og cellulære prosesser ^3,4,28,29.

I pattedyr, oppstår biosyntesen av heme i åtte trinn, som involverer enzymer lokalisert i mitokondriene og cytosol ⁴ (figur 1). Heme BiosynOppgaven begynner i matriksen i mitokondriene med kondensering av glycin og suksinyl-CoA til å danne 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalysert av ALA-syntase (akk) ^4,31. Dette er det hastighetsbegrensende trinnet i biosyntesen heme i nonerythroid celler. 5-ALA blir deretter eksportert inn i cytosolen hvor de neste fire trinn forekommer for å danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som deretter er importert tilbake til mitokondriene, hvor det omdannes til protoporfyrin IX (PpIX). Til slutt blir et molekyl av jern innlemmet i protoporfyrin IX (PpIX) for å produsere heme, en reaksjon katalysert av ferrochelatase (FECH) ^2,4.

Graden av heme biosyntesen avhenger først og fremst av nivået på ALAS enzym som er strengt kontrollert av intracellulære jern og heme ^4. Biosyntesen av heme kan påvirkes av genetiske defekter, tilgjengelighet av visse mineraler og vitaminer (for eksempel, riboflavin, sink), eksponering for giftstoffer (for eksempel, aluminium, bly), Anoksi, feber, og nivåer av visse steroider (f.eks østrogen) ^32-35. Nivået av heme syntese forandres i ulike tilstander syke. Redusert heme biosyntesen kan føre til anemi samt nevrologiske sykdommer ^3,36. Alternativt spiller øket heme biosyntese en viktig rolle i progresjon av visse kreftformer ^28,37. Heme har vist seg å være kritisk for vekst, differensiering og overlevelse hos pattedyr adipose, erytroide og nevronale celler ^4,38-41. For eksempel fører til heme mangel neurite skader i muse kortikale nevroner via inhibering av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) reseptorer ^17. I tillegg hemming av heme-syntesen fører til programmert celledød i menneske epithelial cervix carcinoma HeLa-celler ^26,41. Derfor måle heme biosyntese-nivåer i forskjellige celler under forskjellige forhold er viktig for å studere etiologi og progressipå av mange sykdommer.

Her beskriver vi en rask og følsom metode for å måle nivået av intracellulær heme syntese ved å bruke [4- ¹⁴ C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre metoder som bruker ⁵⁵ eller ⁵⁹ Fe Fe. Vi foretrekker å bruke ¹⁴ C fordi dens stråling er meget svak. I kontrast er sterk beskyttelse som kreves for å arbeide med Fe isotoper. Videre er denne fremgangsmåte beregnet til å måle og sammenligne heme syntese i forskjellige celler i parallell på en rask måte. For å måle absolutte heme nivåer, kan man anvende den tidligere etablerte metoden involverer bruk av HPLC ^42,43.

Protocol

FORSIKTIG: Mens han jobbet med radioaktivitet, ta nødvendige forholdsregler for å unngå forurensning av eksperimentator og omgivelsene. Disponere av alt avfall etter lokale retningslinjer strålingssikkerhet. 1. Utarbeidelse av celler Seed celler i 3,5 cm plater, slik at sammenflytning når 80% -90% på dagen for analysen. Legg merke til at såing sammenflyting for celler er avhengig av celletype og deres vekst. Ved behandling av cellene med et reagens for et bestemt a…

Representative Results

Denne metoden ble anvendt for å sammenligne nivåene av heme-syntese i normal (HBEC30KT) vs. kreft (HCC4017) lungeceller. Figur 2 viser et høyere nivå av heme-syntese i kreftceller (HCC4017) enn normale lungeceller (HBEC30KT). Nivået av heme-syntese ble også målt i normale og kreftceller i nærvær av mitokondriell uncoupler karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Celler ble behandlet med 10 uM CCCP i 24 timer før målingen av heme syntese nivåer. Som forventet, vil nivået av heme-synte…

Discussion

Heme spiller en nøkkelrolle i den generasjonen av mobilnettet energi via respirasjon ^26. Altered heme metabolisme er kjent for å være assosiert med ulike sykdommer, inkludert kreft ^28,41. Hemming av heme-syntesen er kjent for å forårsake cellesyklus og apoptose i Hela celler ^26,41. Det er blitt vist at høy heme syntese nivå er forbundet med progresjon av lungekreftceller ^28. Derfor ville det være av stor betydning for å måle nivåene av heme biosyntese i celler under…

Materials

Acetone	Sigma	650501
Diethy ether	Sigma	296082
HCl (Hydrochloric acid)	Fisher	A481-212
Liquid Scintillation cocktail	MP Biomedicals	882470
Trypan blue	Gibco	15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid	Perkin-Elmer life sciences		Store @  -80 °C
CelLytic M	Sigma	C2978	Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Specific reagent
	Component	Dispense
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)	Acetone	25ml
	Concentrated HCl	1.3ml
	Water	5ml