Zebrafish लार्वा में एकाधिक मुश्किल लक्ष्य ऊतकों Transfect हृदय निलय इंजेक्शन का उपयोग जेनेटिक morpholino दृष्टिकोण रिवर्स
Summary
ऐसे जीन विशिष्ट morpholinos के intraventricular इंजेक्शन का उपयोग कर ऊतक उत्थान के रूप में विकास और शारीरिक homeostasis के बाद के चरणों के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए zebrafish के लिए एक अनुकूलनीय रिवर्स आनुवंशिक विधि.
Abstract
zebrafish सेल और अंग और उपांग उत्थान की आणविक जीव विज्ञान को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है. हालांकि, रिवर्स आनुवंशिकी को रोजगार के लिए आणविक रणनीतियों अभी तक पर्याप्त रूप से zebrafish embryogenesis के बाद लार्वा चरणों के दौरान उत्थान या ऊतक homeostasis में जीन समारोह का आकलन करने के लिए विकसित नहीं किया गया है, और zebrafish लार्वा के भीतर कई ऊतकों लक्ष्य के लिए मुश्किल हैं. जीन विशिष्ट morpholinos के intraventricular इंजेक्शन genomically इन चरणों में एक अस्थायी नियंत्रित तरीके से zebrafish जीनों को लक्ष्य करने के लिए वर्तमान में असमर्थता के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करते हैं. इस विधि पूर्व में इस तरह के लार्वा दुम फिन, अक्सर noninvasively ऊतक उत्थान के लिए अनुसंधान करने के लिए इस्तेमाल एक संरचना में उन के रूप में पहुँचने के लिए असंभव थे कि संरचनाओं सहित पूरे शरीर में विभिन्न ऊतकों में पूरा फैलाव और morpholino के बाद शामिल करने के लिए अनुमति देता है. लार्वा finfold उत्थान के दौरान सक्रिय कई जीनों भी presen रहे हैंवयस्क हड्डीवाला ऊतकों regenerating में टी, ताकि लार्वा वयस्कों में उत्थान को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल है. इस morpholino फैलाव विधि लार्वा ऊतकों के उत्थान के साथ ही embryogenesis के बाद ऊतक homeostasis को विनियमित अन्य शारीरिक घटना के लिए आवश्यक जीन की त्वरित और आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस वितरण पद्धति embryogenesis के बाद जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए अस्थायी नियंत्रण के लिए एक वर्तमान की जरूरत रणनीति प्रदान करता है.
Introduction
अंगों और उपांग के उत्थान के अस्तित्व और फिटनेस के लिए मूल रूप से महत्वपूर्ण है; हालांकि, आदमी सहित कई रीढ़ पुनर्योजी क्षमताओं सीमित है. कई पशु मॉडल व्यापक पुनर्योजी क्षमता है कि मौजूद हैं, अंग और उपांग उत्थान के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए आनुवंशिक तकनीक रिवर्स बहुत ही सीमित या न के बराबर रहते हैं. इसलिए, नए तरीकों को इन मॉडल जीवों में उत्थान की आणविक जीव विज्ञान टुकड़े करना आवश्यक हैं.
zebrafish कई ट्रांसजेनिक मछली लाइनों कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मौजूद है क्योंकि सेल और इसकी वजह से महत्वपूर्ण कई अंगों, ऊतकों और उपांग पुनर्जीवित करने की क्षमता है, लेकिन यह भी की न केवल अंग और उपांग उत्थान 1, आणविक जीव विज्ञान को समझने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है और जीन overexpress करने के लिए 2, 3 निर्माण करती है. हालांकि, लार्वा zebrafish में जीन निषेध मुख्य रूप से overexpre तक सीमित हैजिसका transgene उत्पाद जीन की अंतर्जात गतिविधि प्रतिबिंबित नहीं करते कि लाभ के समारोह प्रभाव प्राप्त कर सकते हैं सभी के हित के जीन या करने के लिए उपलब्ध नहीं हैं, जो प्रमुख नकारात्मक निर्माणों के ssion. इस प्रकार, विशेष रूप से पीटकर या पछाड़ना द्वारा जीन अभिव्यक्ति को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका इन मुद्दों पर काबू पाने की जरूरत है.
TALENS जीन समारोह पीटकर एक रिवर्स आनुवंशिक साधन के रूप में मौजूद है का उपयोग को लक्षित जीन विशिष्ट; जीन की प्रारंभिक आवश्यकताओं भ्रूण के विकास के लिए आगे बढ़ने से रोकने हालांकि, इस वजह पीटकर रणनीति, बहुत बार जल्दी embryogenesis दौरान कार्यात्मक आकलन तक सीमित है. इस प्रकार, इस तरह के TALENS का उपयोग कर विकास के बाद उत्थान या अंग homeostasis के रूप में बाद में घटना के अध्ययन, 5 4 रोका है. इसलिए, एक वैकल्पिक जीन को हटाने की रणनीति पूरी तरह से गठन अंगों और संरचनाओं में जीन की आवश्यकताओं का आकलन करने के लिए प्रारंभिक विकास के बाद जीन समारोह है कि लक्ष्य की जरूरत है. </p>
Morpholino इंजेक्शन कुछ वयस्क अंगों में जीन को निशाना बनाने और वयस्क फिन 6-8 regenerating में प्रभावी होना दिखाया गया है, लेकिन इन तरीकों electroporation की आवश्यकता होती है और कई आंतरिक अंगों के कारण उनके स्थान पर या के कारण बिजली के लिए उनकी संवेदनशीलता को या तो electroporate के लिए मुश्किल हैं विघटन. प्रत्यक्ष इंजेक्शन उनके संरचनात्मक अखंडता को बाधित कर सकता है, क्योंकि या उनके आकार सीमित है, क्योंकि इसके अलावा, लार्वा में कुछ ऊतकों, सीधे इंजेक्षन करने के लिए मुश्किल हैं. finfold में प्रत्यक्ष इंजेक्शन संभव नहीं है क्योंकि लार्वा की दुम का पंख, एक ऐसी संरचना है. इस प्रकार, electroporation और प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए एक विकल्प है या तो इंजेक्षन करने के लिए बहुत छोटे हैं या electroporated नहीं किया जा सकता कि ऊतकों में जीनों को लक्ष्य बनाने की जरूरत थी.
लार्वा दुम फिन के उत्थान के दौरान विशेष जीन के समारोह को निशाना बनाने और बाधित करने के लिए, हम की अनुमति मौजूदा morpholino प्रौद्योगिकियों को संशोधित किया है एकदेर मंचन लार्वा में दुम फिन उत्थान के दौरान जीन समारोह की ssessment. यह विधि एक साथ एंडो पोर्टर अभिकर्मक अभिकर्मक 10 के साथ fluorescein टैग morpholinos के intraventricular वितरण 9 कार्यरत हैं. एक बार जब निलय में, morpholino-एंडो पोर्टर मिश्रण जल्दी वाहिका संरचना के माध्यम से लार्वा भर में फैलता है और लक्षित करने के लिए पहले से असंभव हो गया है कि ऊतकों में प्रवेश करती है. इस इंजेक्शन विधि विशिष्ट ऊतकों में जीन लक्ष्य को संशोधित किया जा सकता है और काफी संभवतः वर्तमान में जीन समारोह को बाधित करने के लिए रिवर्स आनुवंशिक तरीकों की कमी है कि अन्य पशु मॉडल में लागू किया जा सकता है. इस प्रकार, यह तुरंत लार्वा चरणों में सामान्य अंग homeostasis और उत्थान के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए व्यापक रेंज इस्तेमाल के लिए क्षमता के साथ एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
intraventricular इंजेक्शन embryogenesis दौरान जीन समारोह को प्रभावित किए बिना विकास की या शरीर homeostasis के बाद के चरणों में जीन समारोह के परीक्षण के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय मूल्यांकन पद्धति प्रदान करता है. इस तकनीक की सफल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था, हम तकनीकी समर्थन के लिए Ayele Tsedeke Taddese धन्यवाद देता हूँ.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
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