ゼブラフィッシュの幼虫の複数の困難な標的組織をトランスフェクションするために心室インジェクションを用いた遺伝子モルホリノアプローチを逆転
Summary
そのような遺伝子特異モルホリノの脳室内注射を用いた組織再生などの開発および生理学的恒常性の後期段階の間に遺伝子機能を評価するためのゼブラフィッシュに適応逆遺伝学的方法。
Abstract
ゼブラフィッシュは、細胞や臓器や付属物再生の分子生物学を理解するための重要なモデルである。しかしながら、逆遺伝学を採用する分子戦略はまだ十分にゼブラフィッシュ胚形成後の幼虫の段階の間に再生または組織の恒常性における遺伝子機能を評価するために開発されておらず、ゼブラフィッシュの幼生内のいくつかの組織が標的とすることは困難である。遺伝子特異的モルフォリノの脳室内注射は、ゲノムこれらの段階で、時間的に制御された方法でゼブラフィッシュの遺伝子を標的とする現在の無力のための別の方法を提供します。この方法は、以前はこのような幼虫尾鰭、多くの場合、非侵襲的に組織再生を研究するために使用される構造のものと到達することは不可能だった構造を含む全身の様々な組織、に完全に分散し、モルホリノのその後の取り込みが可能になります。幼虫finfold再生中に活性化されるいくつかの遺伝子も、プレゼンしている大人の脊椎動物の組織を再生中のTは、その幼虫は成人で再生を理解するための有用なモデルである。このモルホリノ分散法は、幼虫組織の再生だけでなく、胚発生後の組織恒常性を調節する他の生理現象に必要な遺伝子の迅速かつ容易な同定を可能にする。したがって、この配送方法は胚発生の後、遺伝子機能の評価に時間的制御のために現在必要な戦略を提供しています。
Introduction
臓器や付属の再生は、生存と健康のために根本的に重要である。しかし、ヒトを含むいくつかの脊椎動物は、再生能力が限られている。いくつかの動物モデルは大規模な再生能力を持っている存在するが、臓器及び付属器再生中に遺伝子機能を評価するために、遺伝子技術を逆に非常に限られたまたは存在しないままである。したがって、新たなアプローチがこれらのモデル生物において再生の分子生物学を分析する必要がある。
ゼブラフィッシュは、いくつかのトランスジェニックフィッシュ系統が細胞を追跡するために存在しているため、セルと、その重要な複数の臓器、組織、および付属の再生する能力だけでなく、だけでなく、臓器及び付属器の再生1、の分子生物学を理解するための十分に確立されたモデルであり、遺伝子構築物2、3を過剰発現する。しかし、幼虫ゼブラフィッシュにおける遺伝子阻害は主にoverexpreに制限されていますその導入遺伝子産物の遺伝子の内因性活性を反映していない機能獲得効果を得ることができ、すべての関心のある遺伝子または使用できませんドミナントネガティブ構築物のssion。したがって、具体的ノックアウトまたはノックダウンすることにより遺伝子発現を除去するための代替方法は、これらの問題を克服するために必要とされる。
遺伝子特異的TALENSを用いて標的遺伝子機能をノックアウトするための逆遺伝学的手段として存在する;遺伝子の最初の要件は、胚発生のさらなる進行を防ぐため、しかしながら、このノックアウト戦略は、非常に頻繁に初期の胚発生の間の機能的評価に限定されるものである。したがって、そのようなTALENSを使用して、現像後の再生または臓器の恒常性として、後の現象を研究することは5,4を妨げている。したがって、代替の遺伝子除去戦略は、完全に形成され器官および構造遺伝子の要件を評価するために開発初期に遺伝子機能を標的とすることが必要である。 </P>
モルホリノ注射は、いくつかの成体器官において遺伝子を標的と大人のフィン6-8の再生に有効であることが示されているが、これらの方法は、エレクトロポレーションを必要とし、多くの内臓が、それらの場所またはによる電気に対する感受性のいずれかに電気穿孔することが困難である混乱。直接注入は、それらの構造的完全性を破壊する可能性があるため、又はそれらの大きさが制限されているのでさらに、幼虫の一部の組織は、直接注入することが困難である。 finfoldへの直接注入ができないため、幼虫の尾鰭は、そのような構造です。従って、エレクトロポレーションおよび直接注入する代わりどちらかを注入するには小さすぎる、またはエレクトロポレーションすることができない組織における遺伝子を標的化するために必要であった。
幼虫の尾びれの再生中に特定の遺伝子の機能を標的とし、阻害するために、我々は既存の許可モルホリノ技術を修正したA後期段階の幼虫での尾びれ再生中の遺伝子機能のssessment。この方法は、一緒に遠藤·ポータートランスフェクション試薬10とフルオレセインタグ付きモルフォリノの脳室内配達9を採用しています。一度心室内、モルホリノ – エンド – ポーター混合物を速やかに血管系を経由して幼虫全体に広がり、ターゲットに、以前には不可能だった組織に入る。この注入方法は、特定の組織中の遺伝子を標的とするように修飾することができ、恐らく、現在、遺伝子機能を阻害するために逆遺伝学的方法を欠いている他の動物モデルに適用することができる。このように、すぐに幼虫の段階で一般的な臓器の恒常性と再生の間に遺伝子機能を研究するため、広範な用途の可能性を迅速かつ簡単な方法を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳室内注射は、胚発生の間の遺伝子機能に影響を与えることなく、現像または身体の恒常性の後期段階での遺伝子機能を試験するための迅速かつ信頼性のある評価方法を提供する。この技術の成功を確実にするためには、4つの重要な点に注意する必要があります。針のうち1）針のサイズ、2）乾燥、3）音量を最小にし、鎮静溶液中の4）最小限の露光時間。大きすぎる針が心室に損傷を与え?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、私たちは技術的なサポートのためにAyele Tsedeke Taddeseに感謝したい、ドイツ学術振興（DFG）によってサポートされていました。
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
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