Para aplicaciones futuras como un parche para reparar desgarros parciales del ligamento cruzado anterior (ACL), las células derivadas de ACL humana fueron aisladas de tejido obtenido durante los procedimientos reconstructivos, expandidas in vitro y cultivados en los andamios de ingeniería tisular. A continuación, se realizó la adhesión celular y la morfología para confirmar la biocompatibilidad de la superficie del andamio.
La lesión del ligamento cruzado anterior es un problema comúnmente encontrado en los individuos activos. Incluso los desgarros parciales de este intra-articular del ligamento de la rodilla conducir a deficiencias biomecánicas que la función y la estabilidad deterioran. Las opciones actuales para el tratamiento de los desgarros del LCA parciales van desde no quirúrgico, el tratamiento conservador con múltiples opciones quirúrgicas, tales como: la modificación térmica, la reparación de un solo paquete, la reconstrucción completa, y la reconstrucción de la parte dañada del ligamento nativo. Pocos estudios, si los hay, han demostrado un método único para la gestión de ser siempre superior, y en muchos casos los pacientes seguir demostrando la inestabilidad persistente y otras comorbilidades.
El objetivo de este estudio es identificar una fuente de células para la utilización potencial en el desarrollo de un parche de ingeniería tisular que podría implementarse en la reparación de un LCA desgarrado parcialmente. Un nuevo protocolo fue desarrollado para la expansión de las células derivadas de patients sometidos a la reconstrucción del LCA. Para aislar las células, tejido HACL picada obtenida durante la reconstrucción del ACL se digirió en una solución de colagenasa. La expansión se realizó usando medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Las células entonces se almacenaron a -80 º C o en nitrógeno líquido en un medio de congelación que consiste de DMSO, de FBS y el medio de expansión. Después de la descongelación, las células HACL derivados fueron luego sembradas en un andamio de ingeniería tisular, de PLAGA (ácido láctico-co-glicólico Poli) y el control de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS). Después de 7 días, SEM se realizó para comparar la adhesión celular a la PLAGA contra el TCPS de control. La morfología celular se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia. SEM (microscopio electrónico de barrido) micrografías demostraron que las células crecieron y se adhirieron sobre ambas superficies de PLAGA y TCPS y fueron confluentes sobre las superficies enteras por día 7. La tinción de inmunofluorescencia mostró morfológica normal, no estresadoAL patrones en ambas superficies. Esta técnica es prometedor para aplicaciones en la regeneración y la reconstrucción de ACL.
El ligamento cruzado anterior (LCA) es un ligamento intraarticular comúnmente lesionado de la rodilla. Aproximadamente 200.000 (LCA) se reportan anualmente en los Estados Unidos. Más del 75% de los pacientes que sufren una lesión del LCA opt para la cirugía reconstructiva ortopédica 1,2,3,4. La intervención quirúrgica está indicada a menudo debido a un inherentemente pobre potencial curativo 3. La reconstrucción del ACL se realiza típicamente por medio de un autoinjerto o aloinjerto de tendón. Autoinjerto y aloinjerto representan el estándar de oro para la reconstrucción, ya que cuentan con altas tasas de éxito, y la reparación con sutura primaria, la otra opción de tratamiento, ha mostrado tasas de fracaso de hasta el 94% 5,6,7.
Desgarros parciales del ligamento cruzado anterior representan el 10% y el 28% de todas las rupturas del LCA 8. En un estudio prospectivo, Noyes et al. Estima que el 50% de los pacientes con desgarros parciales que afectan a más de la mitad de la ACL ACL progresó hasta completar insuficiencia después notratamiento quirúrgico 9. Otros estudios reportan persistente inestabilidad y disminución de la función con menos de 30% de los pacientes capaces de volver a su pre-lesión 9,10,11,12,13 nivel de actividad. Las opciones de tratamiento son limitadas e incluyen modalidades conservadoras, la contracción térmica de permanecer ACL, o la reconstrucción del LCA. Recientemente, ha habido un creciente interés en la reparación primaria aumentada. Estas técnicas utilizan productos biológicos para mejorar la reparación de sutura primarios 14. La investigación reciente ha intentado cosechar-mesenquimales como HACL deriva células madre para eludir limitaciones de injerto, 31,32 pero la validez y la eficacia de estas células es todavía desconocido. La fuente de células ideal para aplicaciones de ingeniería de tejidos parece ser no mesechymal HACL deriva células de fibroblastos.
La investigación actual se centra en la identificación de un material de matriz adecuado y fuente de células para el andamiaje de ingeniería. Es un procedimiento estándar para una rotura de ligamentos que ser descartado como doresiduos rgical durante la cirugía de reconstrucción, sin embargo, este ligamento dañado puede ser una fuente de calidad para la adquisición de células necesarias para desarrollar y mejorar un tejido ideal de ingeniería reemplazo ACL. Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo para la expansión in vitro de estas células derivadas HACL cosechados. El uso de una matriz 2D diseñado infundido con células HACL derivados, hemos diseñado un parche que podrían aumentar la reparación del LCA parcial y fortalecer los ligamentos desgarrados.
El objetivo principal de este estudio andamio hACL/2D era utilizar las células obtenidas en un parche para aumentar la reparación primaria del LCA se desgarra parciales. El tratamiento no quirúrgico de las rupturas del LCA parciales puede incluir un breve período de inmovilización, refuerzos, un programa de rehabilitación progresiva, y las evaluaciones de seguimiento regulares 13,16,17. Sin embargo, muchos estudios demuestran que el tratamiento conservador en los atletas se ha asociado con malos resulta…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer el fondo inicial y el departamento de cirugía de la beca de investigación de la Universidad del Sur de Illinois, Facultad de Medicina; y la beca de la Fundación Memorial Medical.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Petri-dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 40C |
DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -800C |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 40C |
Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -800C |
TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 40C |
Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -200C |
goat-anti-mouse antibody (20 Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -200C |
Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -200C |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Light Microscope | Olympus | CK40 | |
Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
Vortex | Labnet | VX-200 | |
Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12mm disks |
Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1g i.v. |
Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
4.5mm shaver | Arthrex | ||
Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
Sputter Coater | Polaron | E5400 |