Recupero chirurgico, Isolamento e<em> In vitro</em> Ampliamento anteriore umana crociati Cells Legamento di derivazione per applicazioni di ingegneria tissutale
Summary
Per le future applicazioni come una patch per riparare rotture parziali del legamento crociato anteriore (LCA), le cellule derivate ACL umane sono state isolate da tessuti ottenuti durante le procedure ricostruttive, espanse in vitro e coltivati in ingegneria tessutale ponteggi. Adesione cellulare e la morfologia è stata poi eseguita per confermare biocompatibilità sulla superficie patibolo.
Abstract
Lesioni al LCA è un problema comunemente riscontrato nei soggetti attivi. Anche le lacrime parziali di questa intra-articolare del legamento del ginocchio portare a carenze biomeccanici che compromettono la funzione e la stabilità. Le opzioni correnti per il trattamento delle lacrime ACL parziali vanno da incruento, gestione conservativa a molteplici opzioni chirurgiche, come ad esempio: modifica termica, riparazione singolo fascio, ricostruzione completa, e la ricostruzione della parte danneggiata del legamento nativo. Pochi studi, se del caso, hanno dimostrato un metodo unico per la gestione sia costantemente superiore, e in molti casi i pazienti continuano a dimostrare persistente instabilità e di altre comorbidità.
L'obiettivo di questo studio è quello di individuare una fonte cellulare potrebbe ricorrere allo sviluppo di una patch tessutale che potrebbe essere implementata nella riparazione di un ACL parzialmente strappata. Un nuovo protocollo è stato sviluppato per l'espansione di cellule derivate da patienti sottoposti a ricostruzione del LCA. Per isolare le cellule, tessuti HACL macinate ottenute durante la ricostruzione del LCA è stato digerito in una soluzione di collagenasi. Espansione è stata effettuata utilizzando mezzo DMEM/F12 supplementato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Le cellule sono state poi conservati a -80 ° C o in azoto liquido in un mezzo costituito da congelamento DMSO, FBS e il mezzo di espansione. Dopo lo scongelamento, le cellule derivate HACL sono state poi seminate su un ponteggio ingegneria tessutale, plaga (acido lattico-co-glicolico Poly) e il controllo del tessuto della cultura polistirene (TCPS). Dopo 7 giorni, SEM è stata eseguita per confrontare adesione cellulare alla plaga contro il TCPS controllo. Morfologia cellulare è stata valutata mediante immunofluorescenza. SEM (Scanning Electron Microscope) microscopio hanno dimostrato che le cellule crescevano e rispettati su entrambe le superfici plaga e TCP ed erano confluenti su tutta la superficie di giorno 7. Immunofluorescenza mostrava normale, morfologiche non-ha sottolineatoAL modelli su entrambe le superfici. Questa tecnica è promettente per applicazioni nella rigenerazione e ricostruzione del LCA.
Introduction
Il legamento crociato anteriore (LCA) è un legamento intra-articolare comunemente feriti del ginocchio. Circa 200.000 (ACL) lesioni sono segnalati ogni anno negli Stati Uniti. Oltre il 75% dei pazienti con lesioni ACL optare per la chirurgia ricostruttiva ortopedica 1,2,3,4. L'intervento chirurgico è spesso indicato a causa di un potenziale di guarigione per sé mediocre 3. Ricostruzione del LCA in genere viene eseguita per mezzo di un innesto di osso autologo o allogenico tendine. Autologo e allogenico rappresentano il gold standard per la ricostruzione come si vantano tassi di successo elevati, e la riparazione sutura primaria, l'altra opzione di trattamento, ha mostrato tassi di fallimento fino al 94% 5,6,7.
Rotture parziali della ACL rappresentano il 10% al 28% di tutte le lacrime ACL 8. In uno studio prospettico, Noyes et al. Stima che il 50% dei pazienti con rotture parziali che interessano più della metà del LCA progredito per completare ACL insufficienza dopo la non-trattamento chirurgico 9. Altri studi riportano persistente instabilità e la funzione diminuiti con meno del 30% dei pazienti in grado di tornare alle loro pre-infortunio livello di attività 9,10,11,12,13. Le opzioni di trattamento sono limitate e comprendono le modalità conservative, ritiro termico di rimanere ACL, o ricostruzione del LCA. Recentemente, c'è stato un crescente interesse per la riparazione primaria aumentata. Queste tecniche utilizzano farmaci biologici per migliorare la riparazione di sutura primaria 14. Recenti ricerche hanno tentato di raccogliere mesenchimali come HACL derivato cellule staminali per aggirare le limitazioni innesto, 31,32 ma la validità e l'efficacia di queste cellule è ancora sconosciuta. La fonte cellulare ideale per applicazioni di ingegneria tissutale sembra essere non mesechymal HACL derivato cellule di fibroblasti.
La ricerca attuale si concentra sull'identificazione un materiale di matrice adatto e fonte di cellule per il scaffold ingegnerizzati. Si tratta di una procedura standard per un ACL strappato da scartare come surifiuti rgical durante l'intervento chirurgico di ricostruzione, tuttavia, questo legamento danneggiato può essere una fonte di qualità per l'acquisizione di cellule necessarie per sviluppare e valorizzare un tessuto ideale ingegnerizzato sostituzione ACL. Il nostro laboratorio ha sviluppato un protocollo per l'espansione in vitro di queste cellule derivate HACL raccolte. Utilizzando una matrice 2D di ingegneria infuso con celle HACL derivate, abbiamo progettato una patch che potrebbe potenzialmente aumentare la riparazione ACL parziale e rafforzare legamenti strappati.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo primario di questo studio impalcatura hACL/2D stato quello di utilizzare le cellule ottenute in una patch per aumentare la riparazione primaria di lacrime ACL parziali. Gestione incruento di lacrime ACL parziali possono includere un breve periodo di immobilizzazione, tonificante, un programma di riabilitazione progressiva e regolari valutazioni di follow-up 13,16,17. Tuttavia, molti studi dimostrano che il trattamento conservativo negli atleti è stata associata con scarsi risultati e fallimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l'avvio del fondo e il reparto di chirurgia assegno di ricerca presso la Southern Illinois University, School of Medicine; e la concessione Memorial Medical Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri-dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 40C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -800C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 40C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -800C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 40C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -200C |
| goat-anti-mouse antibody (20 Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -200C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -200C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
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