El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.
El embrión de pez cebra se utiliza hoy día para la investigación básica y biomédica para investigar el control genético de los procesos de desarrollo y para modelar las anomalías congénitas. Durante el primer día de vida, el embrión de pez cebra que avanza a través de muchas etapas de desarrollo, incluyendo la fertilización, segmentación, gastrulación, segmentación y la organogénesis de estructuras tales como el riñón, el corazón y el sistema nervioso central. La anatomía de un joven embrión de pez cebra presenta varios desafíos para la visualización y el análisis de los tejidos involucrados en muchos de estos eventos ya que el embrión se desarrolla en asociación con una masa de yema ronda. Por lo tanto, para un análisis preciso y de formación de imágenes de fenotipos experimentales en especímenes embrionarias fijas entre la tailbud y 20 somite etapa (10 y 19 horas después de la fecundación (HPF), respectivamente), tales como las teñidas utilizando un montaje toda la hibridación in situ (desea), se a menudo es deseable eliminar el embrión de la yema de Btodos y a la posición plana sobre un portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la realización de un procedimiento de soporte plano puede ser tedioso. Por lo tanto, plana exitosa y eficiente montaje preparación se facilita en gran medida a través de la demostración visual de la técnica de disección, y también ayudado por el uso de reactivos que facilitan el manejo óptimo de los tejidos. Aquí, le ofrecemos nuestro protocolo DESEO para la detección de uno o dos colores de la expresión génica en el embrión de pez cebra, y demostrar cómo el procedimiento de montaje plana se puede realizar en este ejemplo de una muestra fija de colores. Este protocolo de montaje plana es ampliamente aplicable al estudio de muchas estructuras embrionarias que surgen durante el desarrollo de pez cebra temprana, y puede ser implementado en conjunción con otros métodos de tinción realizadas en muestras de embrión de fijos.
El pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un organismo ampliamente utilizado en el estudio de la biología del desarrollo. El pez cebra son una tropicales, especies de vertebrados de agua dulce pertenecientes a la familia de los ciprínidos. El pez cebra fueron utilizados originalmente para la investigación del medio ambiente para obtener información sobre los riesgos potenciales de los contaminantes del agua, ya que eran fáciles de obtener, baratos y fáciles de mantener 1. En los últimos treinta años, el pez cebra se ha reconocido como un sistema modelo de vertebrados genéticamente manejable para una serie de razones. El pez cebra muestran un alto nivel de conservación anatómica y fisiológica con los vertebrados superiores, incluyendo mamíferos 2,3. Recientes secuencia del genoma anotación ha puesto de manifiesto que aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos un homólogo pez cebra 4. Por ejemplo, muchos genes ortólogos que juegan un papel importante durante el desarrollo del riñón se han identificado entre estas especies 5-7. Este dramatic grado de conservación en relación con la biología celular y molecular ha permitido a los investigadores para crear modelos para una amplia gama de enfermedades humanas en el pez cebra 8, y el pez cebra se han convertido en una herramienta valiosa para identificar posibles terapias de drogas utilizando las pantallas de genética químicas 9.
Por otra parte, el modelo de pez cebra no sólo es capaz de recapitular una serie de complejos procesos de desarrollo y estados patológicos que se observan en los seres humanos, pero varios atributos adicionales también aumentar su atractivo como un organismo modelo para estudios embriológicos. El pez cebra son ovíparos y se reproducen a través de desove de difusión, lo que proporciona a los investigadores un acceso fácil a los embriones desde el inicio de la fertilización 10. Otras ventajas incluyen el tamaño del embrión, la transparencia, y el rápido desarrollo, externa 10. Además, los adultos de pez cebra poseen alta fecundidad y por lo general producen relativamente grandes tamaños de postura que pueden oscilar entre 200 a 500por semana, lo que en última instancia, los investigadores para llevar a cabo experimentos de rendimiento altas, tales como pantallas químicas fenotipo basado, con facilidad 9.
Aún así, a pesar de la gran cantidad de ventajas que se exhiben por el modelo de pez cebra, existen retos que se refieren al análisis y la comunicación de los resultados experimentales obtenidos a partir de las etapas tempranas del desarrollo. En algunos casos, la anatomía inherente del embrión de pez cebra podría oscurecer la visualización de los datos de uno. Después de la fecundación, la célula inicial se somete a múltiples eventos de escisión como progresa el desarrollo 11. Después de la gastrulación, el eje embrionario surge en la fase de tailbud (10 HPF) de tal manera que se envuelve alrededor de la yema 11. Como el desarrollo posterior avanza a través del período de segmentación, el tronco crecerá en masa y también alargar por alargamiento axial de tal manera que una cola junto con una porción del saco vitelino en sí se extiende hacia fuera de la masa central de la yema11. Entre el tailbud y somite etapa 20 (19 HPF), los intentos de observar las características específicas de desarrollo después de la utilización de los distintos protocolos de tinción, tales como el deseo, puede ser un reto tanto para visualizar y fotografiar debido a la geometría del embrión y la opacidad de el saco vitelino. Una forma de eliminar estos retos es eliminar la yema y luego aplanar el embrión en una muestra de dos dimensiones que puede ser analizada de una manera más sencilla.
Los siguientes recursos de protocolo y de vídeo proporcionan una guía para saber cómo deyolk con éxito y plana montar un embrión después de la fijación y la tinción, utilizando el ejemplo de uno o tinción DESEO de dos colores. Deseo es una técnica ampliamente utilizado que permite la detección de ácidos nucleicos específicos en muestras conservadas y por lo tanto permite el sitio (s) de la expresión génica para ser detectado dentro de los tejidos. Técnicas de WISH se han descrito extensamente, y se puede realizar con diversos sustratos de colores, así como la gripesistemas de detección de orescent 12-20. Aquí ofrecemos nuestro protocolo DESEO modificado utilizado para los embriones de pez cebra entre las etapas tailbud y segmentación de desarrollo. DESEO protocolos alternativos, sin embargo, son compatibles con el procedimiento de montaje plana descrita aquí, como se señaló al comienzo del protocolo a continuación. Además, el montaje plano podría ser utilizado en conjunción con cualquier número de técnicas de visualización existentes, como toda la inmunohistoquímica monte, ni etiquetas de seguimiento de linaje celular, que no están escritas en este protocolo. En general, la técnica de montaje plana mejor puede permitir el análisis superior y presentación de los datos obtenidos a partir de experimentos con las primeras etapas del desarrollo embrionario en el pez cebra.
El pez cebra han demostrado ser un organismo modelo de gran valor en toda la comunidad de investigación durante los últimos años. El pez cebra exhiben un alto grado de conservación genética con la de los vertebrados superiores, y las ventajas relacionadas con su anatomía, reproducción y ciclo de vida hacen de esta especie muy susceptible a los análisis experimentales. Por otra parte, el avance de las técnicas moleculares aplicables a la pez cebra ha promovido además el uso de este organismo modelo en la investigación científica. Por ejemplo, una gran variedad de líneas de pez cebra transgénico se han generado para estudiar la progresión de la enfermedad y para responder a muchas preguntas fundamentales que son la base de los mecanismos fundamentales del desarrollo, incluyendo la organogénesis.
Por consiguiente, basado en el uso dinámico de pez cebra en tanto la enfermedad y la investigación del desarrollo, metodologías de etiquetado celular y cuantificación de la señal son un aspecto crucial de análisis de datos. Mientras que los métodos que emplean un fluorescentetibodies se pueden utilizar para detectar la expresión de la proteína en el pez cebra transgénico, los investigadores normalmente se basan en procedimientos estándar como de WISH 12-16 a examinar la localización espacio-temporal de las transcripciones de genes en una, muestra el pez cebra transgénico no fijo. De hecho, el deseo es una de las técnicas más utilizadas en la biología 16, y es una herramienta vital que se utiliza para caracterizar el fenotipo de las mutaciones genéticas y perturbaciones genéticas químicas. No obstante, desea que se asocia con una serie de dificultades y retos potenciales. Para confirmar la especificidad de la ribroprobe antisentido, ribosondas sentido se pueden utilizar como un control para evaluar la especificidad de los patrones de tinción ribosonda antisentido. Mientras que las secciones 4 y 5 se presentan en el orden de etiquetado y detección de una sonda marcada con digoxigenina seguida de la sonda marcada con fluoresceína, este orden se puede invertir. Normalmente, las señales más débiles (genes con niveles de expresión más bajos) se detectan mejor con sondas marcadas con digoxigenina y esta manchadesarrollado primero con un sustrato púrpura, seguido por la detección y la tinción de la señal más fuerte (gen más abundantemente expresado) utilizando el sustrato de color rojo. Sin embargo, si las reacciones de dos colores se van a realizar, se recomienda que diversas combinaciones de etiquetas y sustratos se ponen a prueba para encontrar el procedimiento que sea el más adecuado para la recolección y análisis de datos. Además, los tiempos previstos de bloqueo, de anticuerpos de incubación y el lavado suministrada en los Capítulos 4-5 se adaptan para los embriones de menos de 24 horas después de la fecundación; largos intervalos de estos mismos pasos con embriones mayores pueden conducir a la acumulación de sales en la muestra. Extensas consejos para la solución de problemas DESEO embrión de pez cebra norma ya se han documentado en la literatura 12-16. Podría decirse que el dilema más común es el alto fondo. Se recomienda aumentar el número de lavados MABT en el paso de 4,7 a 15 a 20 lavados, si es necesario, sin embargo, en nuestra experiencia, la adición de la noche a la mañana MABT 'súper-wash'da excelentes resultados cuando se utiliza junto con 10 o más lavados MABT cortos antes de proceder al paso 4.8. Otro ejemplo dilema es pobre infiltración de la sonda, que puede ocurrir con largas ribosondas. Esquila la ribosonda siguiente Paso 3.6 a través de la hidrólisis alcalina puede contrarrestar esto. En nuestra experiencia con las muestras de los jóvenes, no se requiere típicamente esquila sonda. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los parámetros de este tipo pueden ser factores contribuyentes en el resultado de un experimento de DESEO, y sugerimos el examen de soluciones en esta sección útil ya disposición del público en la comunidad, según sea necesario para refinar los parámetros experimentales para DESEO en su propia investigación 12.
Además de las técnicas tradicionales de WISH 12-16, ha habido un surgimiento continuo de los avances en las metodologías de deseo y protocolos alternativos que se han formulado. Estos incluyen nuevas formas de detección de la señal, tales como mediante el uso de fluorescenciacencia 17-19, a los métodos que permiten la localización de microRNAs 20. Aún así, a pesar de las muchas mejoras que se han hecho a los métodos de etiquetado células actuales, la eficacia de estos procedimientos son negados si la mancha (s) no se puede visualizar fácilmente dentro de la muestra de interés en un punto de tiempo deseado. Esta limitación es un problema para los investigadores, especialmente cuando se refiere a las primeras etapas embrionarias de la ontogenia del pez cebra, que podría dar lugar a lagunas en nuestra comprensión de los diversos procesos de desarrollo que se plantean en estos momentos. Durante el desarrollo normal del pez cebra, el saco vitelino disminuye progresivamente de tamaño como los embriones mayores de 11 años. Por lo tanto, en estas etapas de desarrollo posteriores (> 24 horas después de la fecundación), tinción DESEO es bastante sencillo de analizar porque el embrión es más grande en comparación con su contiguo saco vitelino. Sin embargo, este no es el caso de la etapa de yema de cola a somitogenesis temprana (cuando el embrionariamasa se coloca alrededor de la yema), donde el saco vitelino opaco a veces puede oscurecer la visualización de la mancha. En consecuencia, el método de montaje plana fue ideado para ayudar a aliviar los problemas de formación de imágenes y de análisis de datos asociados con la caracterización de las muestras de embrión de pez cebra (esquematizados en la Figura 1 y la Figura 2), y ha sido ampliamente utilizado desde la fenotipificación sistemática de mutaciones genéticas aisladas a partir de las primeras pantallas genéticos a gran escala 21.
Desde el advenimiento de la técnica de montaje plana, el análisis de las etapas tempranas del desarrollo se ha mejorado significativamente. Una vez que la yema de huevo se retira del embrión, es posible colocar el plano de embriones en un portaobjetos de vidrio en la orientación deseada para la imagen. Esta posición de dos dimensiones permite la visualización de todo el embrión de una sola vez, lo que elimina la necesidad de girar la muestra. Numerosos tejidos se encuentran en amplios dominios del embrión, tales comolos precursores que forman la sangre y el riñón. Además, uno puede necesitar para comparar varios tejidos en desarrollo diferentes al mismo tiempo. El montaje plano permite al investigador ver simultáneamente todo el dominio de tales grupos de células, y por lo tanto puede ser de gran ayuda cuantificaciones como una medición de área para un tejido o célula recuentos. Esta técnica ha ayudado en última instancia, conducen a muchos descubrimientos sobre una variedad de mecanismos de desarrollo importantes que subyacen en la hematopoyesis, la neurogénesis y organogénesis. Así, una vez dominado, las solicitudes de esta técnica sencilla para los investigadores son muy importantes.
Por ejemplo, en un estudio que examina la elección linaje durante la hematopoyesis, plana montar preparaciones de embriones de pez cebra en las etapas 14 y 18 somite (ss) se utilizaron para ilustrar los cambios que se produjeron en el patrón de expresión del factor de transcripción PU.1 dedo de zinc entre de tipo salvaje y GATA1 morpholino inyectado embriones 22.Este método permitió la detección de un dominio de PU.1 expandido en 18 SS, lo que indica que GATA1 es más probable que la regulación de la expresión de PU.1 en la masa celular intermedia (ICM) alrededor de este punto de tiempo. Embriones montados en plano adicional teñidas para diferentes genes eritroides incluyendo gtpbp1 y epsin demostraron una pérdida en la expresión de estos genes en mutantes VLT que eran GATA1 – / -. Otros análisis no mostraron cambios en la expresión de los genes del eritroides como biklf y testhymin que se sabe que es independiente de la actividad Gata. Por lo tanto, en conjunto con sus otros resultados experimentales, se reveló que GATA1 es esencial en la regulación de la diferenciación de células dentro del linaje eritroide mielo-. En un estudio de desarrollo de la cresta neural, se utilizaron soportes planos para examinar la expresión Crestin en mont blanc (m610 mob) mutantes en un estudioexaminar los papeles de mont blanc y la función del gen TFAP2A 23. A las 10 y 20 ss, expresión Crestin fue abrogado por completo en la cabeza y se redujo en la región del tronco de mutantes m610 mafia en comparación con la expresión normal de tipo salvaje, en última instancia, ayudar a este grupo a una conclusión sobre la importancia de la mont blanc y TFAP2A regulación durante la formación de la cresta neural. Además, en términos de la organogénesis, montajes planos han permitido el descubrimiento de la presencia de dominios distintos a principios del campo progenitoras renal durante el desarrollo del riñón embrionario de pez cebra, conocido como los pronephros. El embrión de pez cebra ofrece un sistema conservada y sin embargo sencillo anatómicamente para estudiar cómo progenitores renales dan lugar a las unidades de nefrones funcionales que comprenden los pronephros, un proceso conocido como nefrogénesis 6,7 (Figura 4). Análisis montar plana ha sido útil para los dominios de documentos de reprogenitores internos y para diseccionar el resultado de cambios en la señalización de RA durante pronephros que modelan 6,7 (Figura 5), que era desconocida hasta entonces. En conjunto, estos ejemplos sugieren que de hecho hay muchas aplicaciones generales para este piso protocolo de montaje en el estudio de diversos procesos que ocurren durante el desarrollo normal y estados de enfermedad.
Conceptualmente, este procedimiento plana de montaje es bastante simple en general. Sin embargo, las manipulaciones y el grado de finura necesaria para dominar este método puede ser muy difícil de dominar, a falta de demostración visual. Por lo tanto, este protocolo fue compilado para permitir a los investigadores, especialmente los nuevos en el modelo de pez cebra, con la oportunidad de comprender mejor cómo llevar a cabo esta técnica y compartir nuestros consejos sobre los reactivos que pueden optimizar la manipulación de tejidos. Esperamos que este protocolo en última instancia permitirá a otros en la comunidad para perfeccionar las condiciones de la muestra más ideales para ser used para obtener imágenes de alta calidad, análisis de datos y la comunicación de sus resultados en publicaciones. En última instancia, esto debería permitir a los investigadores para superar los obstáculos anatómicos del pez cebra durante la embriogénesis temprana, que puede oscurecer la presentación de los resultados experimentales, y resolver estos a través de la utilización de esta técnica simple pero significativo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación a RAW de cada uno de los siguientes: subvenciones del NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 y R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor arranque Académico de subvención n º 5-FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame Colegio de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas. Nos gustaría agradecer especialmente a Elizabeth y Michael Gallagher, junto con toda la familia Gallagher, quien impartió una generosa donación a la Universidad de Notre Dame para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su extraordinaria dedicación en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista acerca de este trabajo, ya queasí como Marigold (Maripooka) y Zinnia Wingert para proporcionar arrojar naturalmente bigotes felinos para hacer más excelentes herramientas de pestañas para nuestra investigación.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |