השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em> בvivo</em
Summary
היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך> 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.
Abstract
היכולת לעקוב אחר תגובות תא T in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו ואת העיצוב של immunotherapies. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית מערך יעד ניאון (FTA), אשר מנצלת צבעים חיוניים כגון succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE), צבעי לייזר סגול להתרגש (ויולט CellTrace: CTV) וצבעי לייזר אדום להתרגש (Cell הפצת הנשק דיי eFluor 670: CPD ) לcombinatorially ימפוציטים עכבר תווית ל> 250 צבירי תאי ניאון להבחין. צבירי תאים בתוך FTAs אלה ניתן פעמו עם histocompatibility המרכזי (MHC) פפטידים מחייבים ברמה שאני וMHC ברמה השני ובכך לפעול כתאי מטרה לCD8 + ותאים מסוג CD4 + T, בהתאמה. תאי FTA אלה להישאר קיימא ומתפקד באופן מלא, ולכן יכולים להינתן לעכברים כדי לאפשר הערכה של הרג בתיווך תא CD8 + T תאי יעד FTA והל-מדיטציה של תאי CD4 +עמ 'של תאי יעד תא FTA B בזמן אמת in vivo על ידי cytometry זרימה. מאז ניתן להעריך> 250 תאי מטרה בפעם אחת, הטכניקה מאפשרת הניטור של תגובות תא T נגד כמה אפיטופים אנטיגן בכמה ריכוזים ובחזרות מרובות. ככזה, הטכניקה יכולה למדוד את תגובות תא T בשני (למשל גודל המצטבר של התגובה) כמותיים ו( להיטות למשל. פונקציונלית ותגובתיות epitope צולב של התגובה) איכותית ברמה. בזאת, אנו מתארים כיצד FTAs אלה בנויים ולתת דוגמא של איך הם יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך את תגובות תא T הנגרמות על ידי נגיף אבעבועות חיסון רקומביננטי.
Introduction
תאי T לשחק תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית אדפטיבית ולעתים קרובות יעד למניפולציה באימונותרפיה. תאי T מסוג CD4 + מפעיל להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים המסדירים היבטים רבים של חסינות והוא יכול גם לעזור באופן ישיר תאי B לייצר נוגדנים. תאי CD8 + T ציטוטוקסיים (הרג) יכולים גם להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים כמו גם משחק תפקיד מרכזי באופן ישיר הרג תאי מבטאי אנטיגן זר. האינטראקציה הבסיסית שיוזמת פונקציות מפעיל תא T אלה כרוך באינטראקציה של קולטן תא T (TCR) עם פפטידים זרים המוצגים על מולקולות MHC על פני השטח של תאים. תאים מסוג CD4 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה השניה בתאי המציגים אנטיגנים ותאי CD8 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה שאני שמוצגים בדרך כלל בתאי חיידק נגוע.
על מנתכדי להעריך את תפקיד תאי T לשחק בתגובה חיסונית, זה חיוני כי פונקציות מפעיל שלהם נמדדות על ידי טכניקות אמינות ורגישות. שיטות נפוצות להערכת תגובת תא T כוללות; MHC class-I/II/peptide תגובתיות tetramer; ייצור ציטוקינים על ידי ELISPOT ומכתים ציטוקינים תאיים; והורג את הקיבולת על ידי 51 מבחני Cr-שחרורו. מבחני אלה, לעומת זאת, מבוצעים בדרך כלל ex vivo עם גירוי במבחנה, או לספק תובנה מוגבלת לתפקוד תא T. באופן אידיאלי, כאשר מודדים תגובות תא T זה יהיה מועיל להעריך אותם באתרו, in vivo כפי שהם מתרחשים, ללא מניפולציה של תאי T כדי למנוע שינויים בפרמטרים תפקודיים שעלולים להתרחש באמצעות גירוי במבחנה. חלק הנפוץ ביותר במבחני תא T vivo פונקציונליים מבוססים על מדידת הרג CTL בתיווך של תאי היעד פעמו עם פפטידים אני מחייב כיתת MHC, המנויים בvivoבאמצעות זיהוי שלהם באמצעות תיוג ניאון עם צבעים חיוניים כגון CFSE. בעוד סוגים אלה של מבחני יכולים לפקח על הרג CTL בתיווך של מטרות כשהם קורים in vivo, יש להם יכולת מוגבלת יחסית להעריך הריגתם של מטרות מרובות הצגת ריכוזים שונים וסוגים שונים של אפיטופים פפטיד, אשר נדרש כדי לאפשר לפרמטרים איכותיים כגון בעבר להיטות כפונקציונלית וריאנט epitope תגובתיות צולבת להיות מוערכת. מבחני אלה גם אינם מספקים שום מידע על תגובות תא בתיווך מסוג CD4 + T.
כדי להתגבר על רב מהמגבלות עם שיטות הנוכחיות שימשו להערכת תגובות תא T, שפתחנו לאחרונה זמנית assay המבוסס על מערכי ניאון יעד (FTAs), המאפשר הניטור של תגובות תא T נגד> 250 תאי המטרה בו זמנית בחיה אחת על ידי cytometry זרימת 1, 2. FTAs מורכב של לימפוציטים שכותרתו עם sevריכוזי eral ושילובים של צבעים חיוניים כמו CFSE, CTV ועלות לכל יום ומאפשרים> 250 צבירי תאים של הקרינה ייחודית להיות שנוצרו. מכיוון שהתאים אלה נשארים קיימא ומתפקד באופן מלא, הם יכולים להיות מוזרקים לבעלי חיים כדי לאפשר ניטור של האינטראקציה שלהם עם תאי T מפעיל in vivo 3. לדוגמא, יכולים להיות פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC כדי לאפשר הערכה של הרג CTL בתיווך אנטיגן הספציפי של תאי יעד 1. בנוסף, יכולים להיות גם פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים, המאפשרים הערכה של תא T מסייע אנטיגן ספציפי לפעילות (T H) על ידי הערכת הפעלה (על ידי הערכה של סמני הפעלה כגון CD69, CD44 ו / או CD62L) של תאי B בתוך FTA נושאים פפטיד מאותו המקור 2. מאז ניתן לאתר יותר מ -250 מטרות בו זמנית, ניתן למדוד תגובות CTL וT H נגד צבירי תאים רבים יעד פעמו עם nפפטידים umerous בריכוזים שונים וההכללה של משכפל רבים. Assay FTA לכן מספק רמה חסרת תקדים של הערכת תגובת מפעיל תא T in vivo.
כאן אנו מתארים בפירוט את הבנייה של FTA ולהראות עד כמה הם יכולים להיות מיושמים להערכת תגובות תא T in vivo. הנוהל מתאר את בניית FTA המורכב מ252 צבירי תאים ניתן להבחין באמצעות השימוש בשלושה צבעים חיוניים, מורכבים 6 חזרות של 42 צבירי תאים פעמו עם MHC ברמה שאני ופפטידים השני מחייבים. התיוג של 42 צבירי תאים מתרחש ב10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות וזה עוזר להוציא אלה במעמד צינור כמתואר בטבלה 1. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למספרים קטנים יותר של אשכולות להבחין כפי שנדרשה על ידי הפחתת הכמות של תיוג של כל צבע שבוצע 1.
אנו מדגישים את התועלת של assay על ידי מראה איך זה יכול למדוד responses שנוצר על ידי חיסון אבעבועות וירוס רקומביננטי נגד אפיטופים מרובים במדגם קטן של עכברים. זה מראה כיצד assay FTA יכול לשמש כדי למדוד את התגובות מצטברות ולהיטות פונקציונלית דרך, בהתאמה, את השימוש בשטח תחת עקומת הערכות (AUC) ומדידת ריכוז הפפטיד יעיל נדרש ליצור תגובות מחצית מקסימליים (50 EC).
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון של מבחני מבוססי FTA הוא שהם מאפשרים אפליה מ> 250 אוכלוסיות תאי יעד קיימא ומתפקד באופן מלא מבעלי חי מארח אחד על ידי cytometry זרימה. זה מספק רמת המורכבות לin vivo מבחני מבוססים cytometry זרימה שלא היו אפשרי בעבר. זה מודגש בניסויים בבעלי החיים 2 הראו לעיל, שבו תגובות ל7 אפיט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענקים # 1010395 (CP BQ ו) ו# 525,431 (CR), ותכנית # גרנט 455,395 (CP) מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומית של אוסטרליה, מרכז אוסטרלי לצהבת והאיידס וירולוגיה EOI 2012 מענק (CR וRJJ) ומענק מטעם קרן גורדון וגרטל רועת הדובים (BQ ו CR). ברצוננו להודות Harpreet Vohra ומיכאל Devoy לתחזוקה שלהם המעולה של המעבדה JCSMR FACS, המתקן האוסטרלי לחקר סרטן קרן Biomolecular המשאבים, JCSMR, ANU, לסינתזת פפטיד, וד"ר דוד בויל, מעבדות CSIRO לבריאות בעלי חיים, ילונג, אוסטרליה למתן מניות חיסון הורה ה-HIV.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
