El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em> En vivo</em
Summary
La capacidad de controlar las respuestas de células T en detalle en vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune. Aquí se describe el uso de conjuntos de blancos fluorescentes (TLC) en un ensayo in vivo de células T en el que evalúa> 250 parámetros simultáneamente por citometría de flujo.
Abstract
La capacidad de monitorear las respuestas de células T in vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune y el diseño de inmunoterapias. Aquí se describe el uso de la tecnología fluorescente matriz de destino (TLC), que utiliza colorantes vitales como succinimidiléster carboxifluoresceína (CFSE), colorantes excitables láser violeta (violeta CellTrace: CTV) y colorantes excitables láser rojo (proliferación de células tinte eFluor 670: CPD ) para combinatoriamente linfocitos de ratón de etiquetas en> 250 grupos de células fluorescentes discernibles. Grupos de células dentro de estos TLC pueden ser pulsados con mayor de histocompatibilidad (MHC) de péptidos de unión de clase I y MHC de clase II y por lo tanto actúan como células diana para CD8 + y células T CD4 +, respectivamente. Estas células TLC siguen siendo viables y completamente funcional, y por lo tanto se pueden administrar en ratones para permitir la evaluación de CD8 + T muerte celular mediada de células diana TLC y CD4 + T de células HEL-meditadop de las células diana de células B TLC en tiempo real in vivo por citometría de flujo. Desde> 250 células diana pueden evaluarse a la vez, la técnica permite el seguimiento de las respuestas de células T contra varios epítopos de antígeno a varias concentraciones y en múltiples repeticiones. Como tal, la técnica puede medir las respuestas de células T a una cuantitativa (por ejemplo, la magnitud de la respuesta acumulativa) ambos y un (por ejemplo. Avidez funcional y-epítopo Reactividad cruzada de la respuesta) cualitativa nivel. Aquí se describe cómo se construyen estos TLC y dan un ejemplo de cómo se pueden aplicar para evaluar las respuestas de células T inducida por una vacuna de virus de la viruela recombinante.
Introduction
Células T juegan un papel central en la respuesta inmune adaptativa y, a menudo son objeto de manipulación en la inmunoterapia. Las células T efectoras CD4 + responden al antígeno extraño secretando citoquinas que regulan muchos aspectos de la inmunidad y también puede ayudar directamente a las células B para la fabricación de anticuerpos. Células T citotóxicas CD8 + (CTL) también pueden responder a antígeno extraño mediante la secreción de citoquinas así como jugando un papel central en matar directamente las células que expresan un antígeno extraño. La interacción fundamental que inicia estas funciones efectoras de células T implica la interacción del receptor de células T (TCR) con péptidos extraños que aparecen en las moléculas MHC sobre la superficie de las células. Células T CD4 + reconocen péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase II en las células presentadoras de antígeno y células T CD8 + reconocen péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase I que típicamente se muestran en las células infectadas por microbios.
En ordenpara evaluar el papel de las células T juegan en una respuesta inmune, es esencial que sus funciones efectoras se miden por técnicas fiables y sensibles. Los métodos comunes para la evaluación de la respuesta de células T incluyen; MHC class-I/II/peptide reactividad tetrámero; producción de citocinas por ELISPOT y tinción intracelular de citoquinas; y matando a la capacidad por 51 ensayos de Cr-liberación. Estos ensayos, sin embargo, se llevan a cabo típicamente ex vivo con la estimulación in vitro, o proporcionan información limitada en función de células T. Idealmente, cuando la medición de respuestas de células T sería beneficioso para evaluar in situ, in vivo como se producen, sin la manipulación de las células T a fin de evitar cambios en los parámetros funcionales que se pueden producir a través de la estimulación in vitro. Algunas de las más utilizadas en vivo T ensayos funcionales de células se basan en la medición de la matanza CTL mediada por células diana pulsadas con péptidos MHC de clase I-vinculantes, que se enumeran en vivoa través de su detección mediante marcaje fluorescente con colorantes vitales como la CFSE. Si bien estos tipos de ensayos pueden supervisar la matanza CTL mediada de objetivos cuando ocurren in vivo, han tenido previamente una capacidad relativamente limitada para evaluar la matanza de blancos múltiples que presentan diferentes concentraciones y diferentes tipos de epítopos peptídicos, que se requiere para permitir a los parámetros cualitativos, avidez como funcional y variante epítopo reactividad cruzada que deben evaluarse. Estos ensayos también no proporcionan ninguna información sobre las respuestas mediadas por células T CD4 +.
Para superar muchas de las limitaciones con los métodos actuales utilizados para evaluar las respuestas de células T, hemos desarrollado recientemente un ensayo múltiple basado en matrices fluorescentes objetivo (TLC), lo que permite el seguimiento de las respuestas de células T contra> 250 células diana simultáneamente en un animal por la citometría de flujo 1, 2. TLC se componen de linfocitos marcados con sevrales concentraciones y combinaciones de colorantes vitales como la CFSE, CTV y CPD permitiendo> 250 grupos de células de fluorescencia único que se generen. Puesto que estas células permanecen viables y completamente funcional, que pueden ser inyectados en los animales para permitir la monitorización de su interacción con células T efectoras in vivo 3. Por ejemplo, los grupos de células del TLC pueden ser pulsadas con péptidos I-vinculante-MHC de clase para permitir la evaluación de matar CTL mediada por antígeno específico de células diana 1. Además, los grupos de células TLC también pueden ser pulsadas con péptidos del MHC de clase II-de unión, lo que permite la evaluación de antígeno específico de células T auxiliares (T H) mediante la evaluación de la actividad de activación (por evaluación de marcadores de activación tales como CD69, CD44 y / o CD62L) de las células B en el TLC que llevan péptido afín 2. Desde hace más de 250 objetivos se pueden detectar de forma simultánea, es posible medir las respuestas de CTL y T H contra muchos grupos de células diana pulsadas con npéptidos umerosos a diferentes concentraciones y la inclusión de muchas repeticiones. Por tanto, el ensayo de TLC proporciona un nivel sin precedentes de la evaluación de la respuesta T efectoras de células in vivo.
A continuación se describe en detalle la construcción de un acuerdo de libre comercio y mostrar la forma en que se pueden aplicar a la evaluación de las respuestas de células T in vivo. El procedimiento describe la construcción de un TLC compuesta de 252 grupos de células discernibles a través de la utilización de tres colorantes vitales, compuestos de 6 repeticiones de 42 grupos de células pulsadas con MHC de clase I y II de unión a péptidos. El etiquetado de los 42 grupos de células se produce en 10 ml de fondo cónico de tubos y que es útil para poner éstos hacia fuera en un bastidor de tubo como se muestra en la Tabla 1. Este método se puede ajustar para un número menor de grupos discernibles como es requerido por la reducción de la cantidad de etiquetado de cada colorante a cabo 1.
Se destaca la utilidad del ensayo, mostrando cómo se puede medir la responsES generados por la vacunación de la viruela de virus recombinante contra múltiples epítopos en una pequeña cohorte de ratones. Esto muestra cómo el ensayo de TLC se puede utilizar para medir las respuestas acumuladas y avidez funcional a través de, respectivamente, el uso de área bajo la curva (AUC) y las evaluaciones de medición de la concentración de péptido eficaz requerida para generar respuestas máximas media (CE 50).
Protocol
Representative Results
Discussion
La ventaja de ensayos basados en TLC es que permiten la discriminación de> 250 poblaciones de células objetivo viable y completamente funcional de un solo animal huésped por citometría de flujo. Esto proporciona un nivel de complejidad a fluir ensayos in vivo basados en citometría de que no ha sido posible antes. Esto se pone de relieve en los 2 experimentos con animales muestran arriba, donde las respuestas a 7 epítopos virales distintas a 6 concentraciones podrían ser monitoread…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas del proyecto # 1010395 (BQ y CP) y # 525431 (CR), y un Programa de Subsidios # 455395 (CP) de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia, el Centro Australiano para la hepatitis y el VIH Virología EOI 2012 de subvención (CR y JJR) y una beca de la Fundación Gordon Bootes y Gretel (BQ y CR). Queremos agradecer Harpreet Vohra y Michael Devoy por su excelente mantenimiento del laboratorio JCSMR FACS, el Fondo para la Investigación del Cáncer de Australia Fundación de Recursos Biomolecular, JCSMR, ANU, para la síntesis de péptidos, y el Dr. David Boyle, CSIRO animales Laboratorios de Salud, Geelong, Australia para proporcionar a las poblaciones parentales vacunas contra el VIH.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
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