Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons<em> In vivo</em
Summary
Muligheden for at overvåge T-cellereaktioner i detaljer in vivo er vigtig for udviklingen af vores forståelse af immunresponset. Her beskriver vi brug af fluorescerende target arrays (FTA) i en in vivo T-celle analyse, der vurderer> 250 parametre samtidigt ved flowcytometri.
Abstract
Muligheden for at overvåge T-cellereaktioner in vivo er vigtig for udviklingen af vores forståelse af immunresponset og udformningen af immunterapi. Her beskriver vi brug af fluorescerende target array (FTA) teknologi, som udnytter vitale farvestoffer såsom carboxyfluorescein succinimidylesteren (CFSE), violet laser overgearet farvestoffer (CellTrace Violet: CTV) og rød laser overgearet farvestoffer (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) til kombinatorisk label mus lymfocytter til> 250 skelnelige fluorescerende celleklynger. Celleklynger i disse frihandelsaftaler kan pulset med major histocompatibility (MHC) klasse I-og MHC klasse II-bindende peptider og derved fungere som målceller for CD8 + og CD4 + T-celler. Disse FTA celler forbliver levedygtige og fuldt funktionel, og kan derfor administreres i mus for at muliggøre vurdering af CD8 + T-celle-medieret drab af FTA target-celler og CD4 + T-celle-mediterede HELp af FTA B celle målceller i realtid in vivo ved flowcytometri. Da> 250 målceller kan vurderes på en gang, at teknikken tillader overvågning af T-celle responser mod flere antigen epitoper på flere koncentrationer og i flere gentagelser. Som sådan kan teknikken måle T-celle-responser på både kvantitative (fx den kumulative størrelse af reaktionen) og en kvalitativ (f.eks. Funktionelle aviditet og epitop-krydsreaktivitet af reaktionen) niveau. Heri beskriver vi, hvordan disse frihandelsaftaler er konstrueret og giver et eksempel på, hvordan de kan anvendes til at vurdere T-celle-responser induceret af en rekombinant poxvirus vaccine.
Introduction
T-celler spiller en central rolle i adaptiv immunreaktion og er ofte målrettet til manipulation i immunterapi. CD4 +-effektor-T-celler reagerer på fremmed antigen ved at udskille cytokiner, der regulerer mange aspekter af immunitet, og kan også direkte hjælper B-celler til at fremstille antistoffer. CD8 +-cytotoksiske T-celler (CTL'er) kan også svare på fremmed antigen ved at udskille cytokiner såvel som at spille en central rolle i direkte at dræbe celler, der udtrykker et fremmed antigen. Den grundlæggende interaktion, der initierer disse T-celle-effektorfunktioner involverer interaktionen af T-cellereceptoren (TCR) med fremmede peptider vises på MHC-molekyler på overfladen af celler. CD4 + T-celler genkender peptider vises på MHC klasse II-molekyler på antigenpræsenterende celler og CD8 +-T-celler genkender peptider vises på MHC-klasse-I-molekyler, som typisk vises på mikrobe-inficerede celler.
Forat vurdere den rolle T-celler spiller i et immunrespons, er det vigtigt, at deres effektorfunktioner måles ved pålidelige og følsomme teknikker. Almindelige metoder til T vurdering celle respons omfatter; MHC class-I/II/peptide tetramer reaktivitet; cytokinproduktion af ELISPOT og intracellulær cytokin-farvning; og dræbe kapaciteten med 51Cr-frigivelse assays. Disse assays er imidlertid typisk udføres ex vivo med in vitro-stimulering eller give begrænset indsigt i T-cellefunktion. Ideelt, når man måler T-celle responser det ville være gavnligt at vurdere dem i situ, in vivo som de opstår, uden manipulation af T-celler for at undgå ændringer i funktionelle parametre, der kan opstå ved in vitro-stimulering. Nogle af de mest almindeligt anvendte in vivo T-celle funktionelle assays er baseret på måling af CTL-medieret drab af målceller pulset med MHC klasse I-bindende peptider, der er opført i vivovia deres opdagelse gennem fluorescerende mærkning med vitale farvestoffer, såsom CFSE. Mens disse typer af analyser kan overvåge CTL-medieret drab på mål, når de sker in vivo, har de tidligere haft en forholdsvis begrænset kapacitet til at vurdere drab på flere mål, som giver forskellige koncentrationer og forskellige typer af peptid-epitoper, som er nødvendige for, at de kvalitative parametre som funktionelle grådighed og epitop variant krydsreaktivitet skal vurderes. Disse analyser heller ikke give nogen oplysninger om CD4 + T-celle-medierede responser.
For at overvinde mange af de begrænsninger med nuværende metoder til at vurdere T-celle responser, vi har for nylig udviklet en multiplex assay baseret på fluorescerende target arrays (FTA), som giver overvågning af T-celle responser mod> 250 målceller samtidigt i et dyr ved flowcytometri 1, 2. Frihandelsaftaler består af lymfocytter mærket med sevterale koncentrationer og kombinationer af vitale farvestoffer som CFSE, CTV og CPD tillader> 250 celle klynger af unikke fluorescens, der skal genereres. Da disse celler forbliver levedygtige og fuldt funktionel, kan de injiceres i dyr for at tillade overvågning af deres interaktion med effektor T-celler in vivo 3. For eksempel kan FTA celleklynger pulseres med MHC klasse I-bindende peptider til at muliggøre vurdering af antigen-specifik CTL-medieret drab af målceller 1. Desuden kan FTA celleklynger også pulset med MHC-klasse-II-bindende peptider, tillader vurdering af antigen-specifik T hjælper celle (T H)-aktivitet ved at vurdere aktivering (ved vurdering af aktivering markører, såsom CD69, CD44 og / eller CD62L) af B-celler i FTA bærer beslægtet peptid 2. Da mere end 250 mål kan detekteres samtidigt, er det muligt at måle CTL-og T H reaktioner mod mange mål celleklynger pulset med numerous peptider i forskellige koncentrationer og inddragelse af mange gentagelser. Frihandelsaftalen analysen giver derfor et hidtil uset niveau af T-celle effektor respons vurdering in vivo.
Her beskriver vi i detaljer opbygningen af en frihandelsaftale og vise, hvordan de kan anvendes til at vurdere T-celle responser in vivo. Fremgangsmåden beskriver konstruktionen af en FTA består af 252 skelnelige celleklynger ved brug af tre vitale farvestoffer, der består af 6 gentagelser af 42 celleklynger pulset med MHC klasse I og II-bindende peptider. Mærkningen af 42 celleklynger forekommer i 10 ml konisk bund rør, og det er nyttigt at lægge disse ud i et rør rack som vist i tabel 1. Kan denne metode korrigeret for mindre antal mærkbar klynger som krævet ved at reducere mængden af mærkning hvert farvestof udført 1.
Vi fremhæver nytten af analysen ved at vise, hvordan den kan måle responses genereret af rekombinant kopper-virus vaccination mod flere epitoper i en lille kohorte af mus. Dette viser, hvordan FTA Assayet kan anvendes til at måle kumulative responser og funktionel aviditet gennem henholdsvis anvendelse af arealet under kurven (AUC) vurderinger og måling af effektiv peptid koncentration, der kræves for at generere halve maksimale responser (EC 50).
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordelen ved FTA-baserede analyser er, at de tillader diskrimination af> 250 levedygtige og fuldt funktionel mål cellepopulationer fra en enkelt værtsdyr ved flowcytometri. Dette giver en grad af kompleksitet til in vivo Flowcytometri baserede assays, som ikke har været muligt før. Dette fremhæves i de 2 dyreforsøg vist ovenfor, hvor reaktioner på 7 forskellige virale epitoper ved 6 koncentrationer kan overvåges i replikater af 6 samtidigt i et enkelt dyr tillader parametre såsom AUC og EC 50</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af projekttilskud # 1010395 (BQ og KP) og # 525.431 (CR), og et program Grant # 455.395 (KP) fra Sundhed og Medical Research Council i Australien, en australsk Center for hepatitis og HIV Virologi EOI National 2012 tilskud (CR og RJJ) og en bevilling fra Gordon og Grete Bootes Foundation (BQ og CR). Vi vil gerne takke Harpreet Vohra og Michael Devoy for deres fremragende vedligeholdelse af JCSMR FACS laboratorium, den australske Cancer Research Foundation Biomolekylær Resource Facility, JCSMR, ANU, for peptid syntese, og Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien for at give de stiftende HIV-vaccine bestande.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
