Én-kanals Cell-attached Patch-clamp optagelse

Summary

Beskrevet her er en procedure for at opnå lange strækninger af aktuelle optagelse fra en ion-kanal med celle-attached patch-clamp teknik. Denne metode giver mulighed for at observere, i realtid, mønsteret for open-close kanal konformationer, der ligger til grund for biologisk signal. Disse data informere om kanal ejendomme i uforstyrrede biologiske membraner.

Abstract

Ionkanalproteiner er universelle udstyr til hurtig kommunikation på tværs af biologiske membraner. Den tidsmæssige underskrift ioniske flux de genererer, afhænger af egenskaber iboende hver kanal protein samt den mekanisme, hvormed det er genereret og kontrolleres og repræsenterer et vigtigt område af den aktuelle forskning. Information om de operationelle dynamik ionkanalproteiner kan opnås ved at observere lange strækninger af strøm produceret af et enkelt molekyle. Beskrevet her er en protokol for at opnå en-kanals celle-attached patch-clamp aktuelle optagelser til en ligand ionkanal, NMDA-receptoren, udtrykt heterologt i HEK293-celler eller indbygget i corticalneuroner. Også er vejledning i at tilpasse metoden til andre ionkanaler af interesse ved at præsentere eksemplet med mekanisk-følsomme kanal PIEZO1. Denne metode kan give data om kanalens ledningsevne egenskaber og den tidsmæssige rækkefølge af OPEn-lukkede konformationer, der udgør kanalens aktivering mekanisme, og dermed hjælpe til at forstå deres funktioner i sundhed og sygdom.

Introduction

Hurtig kommunikation på tværs af biologiske membraner bygger næsten udelukkende på oligomere poredannende membranproteiner, der almindeligvis omtales som kanaler. Disse proteiner er meget forskellige i aktivering signaler, gating mekanismer og ledningsevne egenskaber. Kanal proteiner, hvis porer er selektiv for ioner er klassificeret som ionkanaler; deres aktivering producerer ionstrømme over membranen, og deres svar kan optages med høj opløsning i realtid ved hjælp elektrofysiologiske teknikker. Signalerne aktivering spænde en bred vifte af kemiske og fysiske input herunder koncentrationsgradienter, mekaniske og elektriske kræfter og temperatur; således yderligere klassificere ionkanaler i ligand gated, mekanosensitive, spænding gated, eller varmefølsomme typer. I denne artikel, protokoller beskrevet til at optage én kanal aktivitet fra en ligand gated kanal, NMDA-receptoren, og en mekanosensitive kanal, PIEZO1, ved hjælp af patch-clamp teknik.0;

Patch-clamp elektrofysiologi er den første og mest udbredte eksperimentelle metode tilstrækkeligt følsomme til at tillade observation af enkelte molekyler ^{1, 2.} Ud over denne udsøgte følsomhed, er det langt udvidet biologiske præparater kan underkastes elektrofysiologiske optagelse og har også tilladt observation af ionkanaler i intakte membraner. Først, fordi både spændingsfikseringsenheden og aktuelle optagelse opnås med den samme elektrode, kan det bruges til at optage signaler tværs små celler eller membraner patches. Teknikken viste, at ion-kanaler, der ikke er begrænset til overgearet membraner af frøen muskler, ål electroplaques eller blæksprutte gigant axoner ^{3, 4,} men snarere, at de repræsenterer allestedsnærværende inventar af transmembrane signalering mekanismer og er uløseligt forbundet med alle cellulære membran typer af uni-eller flercellede organismer, og også til intracellulære membraner. Importantly, kapacitet til at optage transmembrane strømme ved blot at knytte et glas pipette til en intakt celle forudsat den enestående mulighed for at optage aktivitet fra ion-kanaler i deres oprindelige uafbrudt membraner. Således celle vedhæftet patch-clamp teknik, som er beskrevet i denne protokol, tillader overvågning af aktiviteten af ​​ionkanaler kontinuerligt for snesevis af min eller længere i deres oprindelige miljø.

Under normale termiske fluktuationer, alle proteiner, herunder ionkanalproteiner undergår strukturelle ændringer over en bred tidshorisont, med de hurtigste og mest hyppige omrokeringer repræsenteret mest sandsynligt ved side-chain bevægelser og meget langsommere, mindre hyppige ændringer repræsenteret ved repositionering af hele domæner eller underenheder, eller i nogle tilfælde ved post translationelle modifikationer eller protein-protein interaktioner ^{5, 6.} Observere lange perioder med aktivitet genereret af ét molekyle kan hjælpe med at forstå funknale dynamik ion-kanaler i intakte fysiologiske membraner og giver værdifulde oplysninger om den operationelle mekanisme af molekylet overholdes.

I modsætning til den voksende forståelse af mangfoldigheden i ionkanaler tværs celletyper og udviklingsstadier, viden om den molekylære sammensætning af ionkanaler i native membraner er stadig begrænset. Alle ionkanaler er multimere proteiner og størstedelen af ​​native ionkanaler samle fra flere typer af underenheder, der producerer proteiner af brede molekylære mangfoldighed, der ofte er ledsaget med forskellige ledningsevne og gating egenskaber. Af denne grund er ionkanaler definerede molekylære sammensætning undersøgt ved ekspression i heterologe systemer. Navnlig HEK293-celler, som er en klonal linje af immortaliserede humane embryonale nyreceller ^7, vundet udbredt accept som det foretrukne system til heterolog ekspression af rekombinante ionkanaler. Blandt mandeny fordele, forhøjede HEK293 celler som valget for ion-kanal elektrofysiologi er den lethed og overkommelige dyrkning og vedligeholdelse af langlivede stabile kulturer, deres evne til at udføre post-translationel foldning, forarbejdning og handel med proteiner fra pattedyr, og i mange tilfælde , deres lave niveau eller endda mangel på endogen udtryk for kanalen af interesse ^{7, 8.} Udtrykke rekombinante ionkanaler og studere deres funktionelle egenskaber i HEK293 celler fortsætter med at være en værdifuld metode til at få information om struktur-funktion egenskaber af ionkanaler samt de særlige egenskaber ionkanal isoformer og deres roller i native væv. De er beskrevet i denne artikel, protokoller kan anvendes lige godt rekombinante ionkanaler udtrykt i HEK293 celler og til at indfødte ionkanaler.

Sammenfattende til patch-clamp teknik, gennem sin enestående evne til at løse signals fra et molekyle er til dato den mest direkte metode til iagttagelse af opførslen af ​​enkelte molekyler. I sin celle-tilsluttet tilstand, patch-clamp optagelse giver mulighed for lange observationsperioder, der, når det gøres til et molekyle, kan yde ekstraordinær indsigt i driften af ​​ionkanaler. Nedenfor præsenteres en protokol for at opnå høj opløsning aktuelle optagelser fra celle vedhæftede plastre indeholdende en ion-kanal protein.

Protocol

1. Celledyrkning og Protein Expression Oprethold HEK293-celler (ATCC CRL-1573) mellem passagerne 22 og 40, som indeholder passager udført af ATCC i monolagskultur i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin blandingen ved 5% CO2 og 37 ° C. Mellem eksperimenter passage celler i T25-flasker på 5-20 gange fortyndinger i et endeligt volumen på 10 ml. Bemærk: Brug af celler under disse passager garanterer gunstig celle sundhed, som vil give mulighed for optim…

Representative Results

Rekombinant NMDA receptorer NMDA-receptorer binder og svare den samtidige virkning af to co-agonister: glutamat og glycin. De samle som heterotetramerer for to glycin bindende GluN1-underenheder og to glutamat bindende GluN2 underenheder. GluN2 subunits kodes af fire gener (AD) og af disse de mest transskriberede former i hjernen, er GluN2A hos voksne og GluN2B i unge dyr. På grund af mangfoldigheden af NMDA-receptorsubtyper i native præparater, der udtrykker receptorer i …

Discussion

I feltet ionkanal er et vigtigt forskningsområde dedikeret til at forstå rækkefølgen af ​​begivenheder, der fører til at kanalisere åbning eller kanalens gating mekanisme. For de fleste kanaler, denne proces er kompleks og involverer flere kinetiske trin, som ikke kan udledes af et makroskopisk multikanal-signal. I modsætning hertil kan man udvikle hvor observere sekvens af åbne / lukkede arrangementer i enkelt kanal rekord kan producere mere detaljerede oplysninger om gating mekanismer. I de her beskrevne m…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1