Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Summary

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Abstract

Ionkanaaleiwitten zijn universele apparaten voor snelle communicatie over biologische membranen. De temporele ondertekening van de ionische flux zij genereren afhankelijk eigenschappen inherent aan elk kanaal eiwit en het mechanisme waardoor het wordt geproduceerd en gecontroleerd en vertegenwoordigt een belangrijk gebied van het huidige onderzoek. Informatie over de operationele dynamiek van ionkanaal eiwitten kunnen worden verkregen door het observeren langgerekte stroom door een enkel molecuul. Hier beschreven is een protocol voor het verkrijgen van een-kanaal-cel bevestigd patch-clamp huidige opnames voor een ligand-gated ionkanalen, de NMDA-receptor, heteroloog tot expressie in HEK293 cellen of native in corticale neuronen. Ook worden instructies over hoe de methode aan te passen aan andere ionkanalen van belang door de presentatie van het voorbeeld van de mechanisch-gevoelige kanaal Piezo1. Deze methode kan gegevens leveren met betrekking tot geleiding eigenschappen van het kanaal en de chronologische volgorde van open-gesloten conformaties die deel uitmaken van de activering mechanisme van het kanaal, hetgeen zal bijdragen tot hun functie in gezondheid en ziekte te begrijpen.

Introduction

Snelle communicatie over biologische membranen vrijwel uitsluitend een beroep op oligomere porievormende membraaneiwitten, meestal aangeduid als kanalen. Deze eiwitten verschillen sterk in activeringssignalen, gating mechanismen en geleiding eigenschappen. Kanaal eiwitten waarvan de poriën zijn selectief ionen worden geclassificeerd als ionkanalen; hun activering produceert ionenstromen over het membraan, en hun antwoorden kunnen worden opgenomen met een hoge resolutie in real time via elektrofysiologische technieken. De activering signalen bestrijken een breed scala aan chemische en fysische-ingangen, waaronder concentratiegradiënten, mechanische en elektrische krachten en temperatuur; dus, verdere indeling van ionkanalen in ligand gated, mechanosensitive, voltage gated, of warmte gevoelige types. In dit artikel worden de protocollen beschreven een-kanaal activiteit opnemen van een ligand-gated kanaal, de NMDA-receptor, en een mechanosensitive kanaal, Piezo1, met behulp van de patch-clamp techniek.0;

Patch-clamp elektrofysiologie is de eerste en meest gebruikte experimentele werkwijze voldoende gevoelig voor de waarneming van afzonderlijke moleculen ^{1, 2} mogelijk. Naast deze uitstekende gevoeligheid heeft enorm uitgebreid de biologische preparaten vatbaar voor elektrofysiologische opname en ook kon de waarneming van ionenkanalen in intacte membranen. Ten eerste, omdat zowel spanning klem en huidige opname wordt bereikt met dezelfde elektrode kan worden gebruikt om signalen op te nemen in kleine cellen of membranen patches. De techniek bleek dat ionkanalen niet beperkt blijven tot prikkelbaar membranen van kikker spieren, paling electroplaques of reuzeninktvis axonen ^{3, 4,} maar eerder dat zij vertegenwoordigen alomtegenwoordig armaturen van transmembraan signaleringsmechanismen en zijn inherent aan alle celmembraan vormen van uni-of meercellige organismen, alsmede intracellulaire membranen. Importantly, de mogelijkheid om transmembraan stromen opnemen door gewoon het aanbrengen van een glazen pipet om een ​​intacte cel op voorwaarde dat de ongekende kans om activiteiten te registreren van ionkanalen in hun eigen ongestoorde membranen. Aldus de cel verbonden patch-clamp techniek die wordt beschreven in dit protocol, maakt controle van de activiteit van ionenkanalen continu tientallen minuten of langer in hun eigen omgeving.

Onder normale thermische schommelingen, alle proteïnen, inclusief ionkanaaleiwitten, ondergaat structurele veranderingen over een breed tijdschaal, de snelste en meest voorkomende herschikkingen vertegenwoordigd waarschijnlijk door zijketen bewegingen en veel langzamer, minder frequente veranderingen voorgesteld door de herpositionering van de gehele domeinen of subeenheden, of in sommige gevallen door posttranslationele modificaties of eiwit-eiwit interacties ^{5, 6.} Observeren lange periodes van activiteit die door een molecuul kan helpen om de functie te begrijpennale dynamiek van ionenkanalen in intacte fysiologische membranen en waardevolle informatie over de operationele mechanisme van het molecuul waargenomen.

In tegenstelling tot het groeiende begrip van de diversiteit van ionenkanalen in celtypes en ontwikkelingsstadia, kennis over de moleculaire samenstelling van ionenkanalen in natieve membranen nog beperkt. Alle ionenkanalen multimere eiwitten en de meerderheid van inheemse ionenkanalen samenstellen uit verschillende soorten subeenheden produceren eiwitten brede moleculaire diversiteit, die vaak gepaard gaat met diverse geleiding en gating eigenschappen. Om deze reden, zijn ionkanalen van gedefinieerde moleculaire samenstelling bestudeerd na expressie in heterologe systemen. Vooral HEK293 cellen, die een klonale lijn van geïmmortaliseerde humane embryonale niercellen ⁷ zijn wijdverspreide acceptatie als het voorkeurssysteem voor heterologe expressie van recombinante ionenkanalen. Onder de many voordelen die HEK293 cellen verhoogd als de keuze voor ionkanalen elektrofysiologie zijn het gemak en betaalbaarheid kweken en onderhouden langlevende stabiele culturen hun bekwaamheid tot het post-translationele vouwen, verwerking en transport van zoogdiereiwitten, en in veel gevallen , hun lage of zelfs afwezigheid van endogene uitdrukking voor het kanaal van belang ^{7, 8.} Recombinant ionenkanalen en het bestuderen van hun functionele eigenschappen in HEK293 cellen blijft een waardevolle benadering voor informatie over de structuur-functie eigenschappen van ionenkanalen en de specifieke eigenschappen van ionkanaal isovormen en hun rol in natieve weefsel verkrijgen. De in dit artikel beschreven protocollen kunnen evengoed worden toegepast om recombinante ionkanalen tot expressie in HEK293 cellen en inheemse ionenkanalen.

Samengevat, de patch-clamp techniek, door zijn ongekende vermogen signaal lossens van het ene molecuul blijft tot op heden de meest directe methode voor het observeren van het gedrag van enkele moleculen. In zijn cel bevestigd mode, patch-clamp-opname maakt het mogelijk lange observatie periodes die, als je klaar bent voor een molecuul, kan uitzonderlijk inzicht geven in de werking van ionkanalen. Hieronder wordt voorgesteld een protocol voor het verkrijgen van de huidige opnamen van hoge resolutie van cel bevestigd pleisters met een ionkanaal eiwit.

Protocol

1. Celkweek en eiwitexpressie Handhaaf HEK293 cellen (ATCC CRL-1573) tussen passages 22 en 40, welke passages uitgevoerd door ATCC, in monolaagkweek in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en 1% penicilline / streptomycine mengsel bij 5% CO2 en 37 ° C. Tussen experimenten werd passage cellen in T25 kolven 5-20 voudige verdunningen in een eindvolume van 10 ml. Opmerking: Het gebruik van cellen tijdens deze passages garandeert gunstige cel gezondheid, die zal zorgen voor een optima…

Representative Results

Recombinant NMDA receptoren NMDA-receptoren binden en te reageren op de gelijktijdige werking van twee co-agonisten: glutamaat en glycine. Ze assembleren als heterotetrameren van twee glycine binden GluN1 subeenheden en twee glutamaat bindend GluN2 subeenheden. GluN2 subeenheden worden gecodeerd door vier genen (AD) en van deze de meest getranscribeerd vormen in de hersenen zijn GluN2A bij volwassen en GluN2B bij jonge dieren. Vanwege de diversiteit van NMDA receptor subtype…

Discussion

In het veld ionkanaal, is een belangrijk gebied van onderzoek gewijd aan het begrijpen van de opeenvolging van gebeurtenissen die leidt tot het openen of gating mechanisme van het kanaal kanaal. Voor de meeste kanalen, dit proces is complex en omvat verschillende kinetische stappen die niet kunnen worden afgeleid uit een macroscopische multikanaals signaal. In tegenstelling, kunnen experimenten worden opgezet waar het observeren van de opeenvolging van open / gesloten gebeurtenissen in single channel record kan meer ged…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1