Summary

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

Published: June 04, 2014
doi:

Summary

כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.

Abstract

פיגומים מתכלים נזרעו עם תאים חד גרעיניים מח עצם (BMCs) משמשים לעתים קרובות לניתוח שחזור לטיפול בחריגות לב מולדת. התוצאות הקליניות ארוך הטווח הראו שיעורי patency מצוינים, עם זאת, עם שכיחות משמעותית של היצרות. כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue כלי דם ומניעת התפתחות היצרות שבתלי רקמה מהונדסות כלי דם (TEVGs), פיתחנו מודל עכבר של השתל עם כ 1 מ"מ קוטר פנימי. ראשית, TEVGs הורכבו מפיגומים צינורי מתכלים מפוברק מלא ארוג חומצת polyglycolic הרגיש רשת מצופה עם קופולימר ε-caprolactone ו-L-lactide. הפיגומים לאחר מכן הושמו בlyophilizer, ונשאבים ל24 שעות, ומאוחסנים בתא ייבוש עד זריעת תאים. שנית, מח עצם נאסף מעכברי תורם ותאים חד גרעיניים היו מבודדים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. שלישית, כמיליון תאים היוזורעים על פיגום וטופחו O / נ לבסוף, פיגומי seeded היו אז מושתלים כמו שתלי חציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. השתלים המושתלים הפגינו patency מצוין (> 90%) ללא עדות לסיבוכים תרומבואמבוליים או היווצרות aneurysmal. מודל עכברי זה יסייע לנו בהבנה וכימות מנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue בTEVG.

Introduction

מומי לב מולדים הם מצבים חמורים המשפיעים על כמעט 8% מלידות חיות בארצות הברית. כ 25% מתינוקות עם מומי לב מולדים או 2.4 ל -1,000 לידה חי, דורשים טיפול פולשני בשנה הראשונה לחייהם 1. הטיפול היעיל ביותר למחלת לב מולדת הוא ניתוח שחזור. למרבה הצער, סיבוכים הנובעים מהשימוש של צינורות כלי דם זמינים כרגע הם הגורם המשמעותי ביותר לתחלואה ותמותה לאחר ניתוח.

כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו את השתלים הראשונים רקמות מהונדסות כלי דם (TEVGs) לשימוש קליני 2. TEVGs נבנו מצינורות פוליאסטר מתכלים נזרעו עם תאי מח עצם עצמי נגזר מונונוקלארים (BM-MNCs) ומושתלים כמוליכי ורידים לניתוח לב מולדים. התוצאות הראו שיעורי patency מעולים ב1-3 שנים של מעקב, אך עם שכיחות משמעותית של היצרות <sעד> 3,4. הייתה ברורה שהבנה טובה יותר של היווצרות neotissue כלי דם ואת המנגנון בסיסי הפיתוח של היצרות TEVG הייתה צורך. על מנת להבין את התפתחות TEVGs והמנגנון של התפתחות היצרות טוב יותר, מודל כבש נוצר 5,6. במודל זה, TEVGs הפך בהצלחה לכלי חיים והיו דומים בשתי מורפולוגיה ותפקוד של ורידי ילידים. שימוש זה במודל חיה גדול היה צעד ראשון טוב במתן מידע טרום קליני חשוב שסייע לשימוש קליני של TEVGs. עם זאת, הבנה מלאה של המנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות כלי דם בneotissue TEVGs באמצעות מודלים של בעלי חיים גדולים היא מוגבלת בשל מגבלות באפיון מולקולרי של פנוטיפים תאי כלי דם בשל חוסר מיני כלים מולקולריים ספציפיים. כדי להתגבר על חסרונות אלה, מודל עכברי של TEVGs פותח על ידי סיבה של הקידום המהיר בגנטיקה עכבר וmolecula הנרחב שלהםאפיון r עם היתרון הנוסף של היקף זמן מקוצר.

מודל החציצה העכברי IVC נאמנות סכם התהליך של neovessel היווצרות המתרחשת בבעלי חיים ובבני אדם גדולים, אבל מעל כמובן זמן קצר הרבה יותר 6-9. כאן, פרוטוקול מפורט לייצור שתל בקנה מידה קטנה באמצעות פיגומים מתכלים, קצירת BM-MNC ובידוד, זריעת BM-MNC על פיגום, והשתלת שתל במודל עכברי תוארו.

Protocol

הערה: כל נהלי בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה בבית חולים בבעלי חיים מוסדי הטיפול ושימוש של הילדים ארצי. 1. שתל ייצור להפוך את פתרון ε-caprolactone וP קופולימר L-lactide (לוס אנג'לס / CL) על ידי ה?…

Representative Results

סכמטי של השתלת TEVG מוצגת באיור 1. מח העצם היה שנקטפו מן עכבר תורם ותאים הגרעיניים מונו בודדו באמצעות צנטריפוגה צפיפות ולאחר מכן זורעים על פיגום מתכלה. פיגומי seeded הודגרו O / N ומושתל לעכבר נמען כשתל חציצה נחותה וריד נבוב. <strong…

Discussion

מודל העכבר של TEVG הוא כלי רב ערך כדי ללמוד מנגנונים תאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue והפיתוח של היצרות. BM-MNC זרע הוצג בשני תמונות היסטולוגית וSEM של תאי זרע על השתל 11. יעילות זריעת תאים הוצגה גם באמצעות assay-DNA 7. שימוש במערכת מודל זה הראה שזריעת תאים מפחיתה את…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה, בין שאר, על ידי מענק מ-NIH (RO1 HL098228) לCKB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
polyglycolic acid (PGA) felt Biomedical Structures Custome ordered
ɛ-caprolactone and L-
lactide copolymer P(LA/CL) 
Gunze Inc. Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl  Fisher Sientific 02-707-456
Lyophilizer  Labconco 7070020
RPMI medium 1604 gibco 11875-093
Petri dish BD 353003
24 well plate Corning 3526
15cc tube  BD 352096
Ficoll Sigma 10831-100ml Also called 'Histopaque'
DPBS gibco 14190-144
Littauer Bone Cutter 4.5" Straight Roboz RS-8480 For BM harvesting
Forceps 4.5" Roboz RS-8120 For BM harvesting
Scissors 4.5" Roboz RS-5912 For BM harvesting
Microscope Leica M80
C57BL/6J (H-2b), Female Jackson Laboratories  664 8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution Akorn Inc. NADA# 139-236
ketoprofen Fort Dodge Animal Health NDC 0856-4396-01
Ibuprofen PrecisionDose NDC 68094-494-59
Heparin Sodium Sagent Pharmaceticals NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium Chloride Injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment Dechra Veterinary Products NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads Triad Disposables, Inc. NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads McKesson Corp. NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators Fisher Sientific 23-400-118
Fine Scissor FST 14028-10
Micro-Adson Forcep FST 11018-12
Clamp Applying Forcep FST 00072-14
S&T Vascular Clamp FST 00396-01
Spring Scissors FST 15008-08
Colibri Retractors FST 17000-04
Dumont #5 Forcep FST 11251-20 
Dumont #7 – Fine Forceps FST 11274-20
Dumont #5/45 Forceps FST 11251-35
Tish Needle Holder/Forceps Micrins MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 AROSurgical Instruments Corporation TI638402 For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 AROSurgical Instruments  SN-1956 For musculature and skin closure
Non-Woven Songes McKesson Corp. 94442000
Absorbable hemostat Ethicon 1961
1 ml Syringe BD 309659
3 ml Syringe BD 309657
10 ml Syringe BD 309604
18G 1 1/2 in, Needle BD 305190
25G 1 in., Needle BD 305125
30G 1 in., Needle BD 305106
Warm Water Recircultor Gaymar TP-700
Warming Pad Gaymar TP-22G
Trimmer Wahl 9854-500

References

  1. Heart Association, A. m. e. r. i. c. a. n. Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
  2. Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
  3. Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
  4. Shin’oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
  5. Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
  6. Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
  7. Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
  8. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
  9. Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  10. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
  11. Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
  12. Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
  13. Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
  14. Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
check_url/51632?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Lee, Y., Yi, T., Tara, S., Lee, A. Y., Hibino, N., Shinoka, T., Breuer, C. K. Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model. J. Vis. Exp. (88), e51632, doi:10.3791/51632 (2014).

View Video