Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila.
O embrião Drosophila tem sido um modelo de laboratório poderosa para elucidar os mecanismos moleculares e genéticos que controlam o desenvolvimento. A facilidade de manipulação genética com este modelo suplantou abordagens farmacológicas que são comuns em outros modelos animais e ensaios baseados em células. Aqui, descrevemos os recentes avanços em um protocolo que permite a aplicação de moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião da mosca de fruta. O método detalha medidas para superar a impermeabilidade da casca do ovo, mantendo a viabilidade do embrião. Casca de ovo de permeabilização através de uma ampla gama de fases de desenvolvimento é conseguido através da aplicação de uma permeabilização anteriormente descrito embrião d-limoneno solvente (EPS 1) e pelo envelhecimento embriões, a temperatura reduzida (18 ° C) antes de tratamentos. Além disso, o uso de um corante vermelho-distante (CY5) como um indicador de permeabilização é descrito, o qual é compatível com aplicações a jusante, envolvendo gripe vermelho e verde padrãocorantes orescent em preparações ao vivo e fixos. Este protocolo é aplicável a estudos utilizando compostos bioativos para investigar os mecanismos de desenvolvimento, bem como para estudos destinados à avaliação da atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados.
O embrião Drosophila continua a ser um modelo privilegiado para investigação dos mecanismos fundamentais do desenvolvimento 2. Este modelo poderoso é suportada por uma grande variedade de técnicas de genética molecular que permitem a manipulação de essencialmente qualquer gene em qualquer ponto de tempo e dentro de qualquer órgão em desenvolvimento. O tamanho pequeno, rápido desenvolvimento, e uma extensa caracterização da morfogênese do embrião Drosophila torná-lo um modelo de escolha para as telas genéticos, muitos dos quais descobertos vias de desenvolvimento fundamentais 3,4. Numerosos fenótipos no embrião de Drosophila têm sido caracterizados e são facilmente interpretável, frequentemente proporcionar um meio para identificar os mecanismos genéticos moleculares subjacentes responsáveis por um traço anormal.
Historicamente, uma desvantagem do modelo de embrião da mosca tem sido a dificuldade de introdução de moléculas pequenas para tecidos embrionários. Esse obstáculo tem colocado limitações: 1) nosção conhecidos pequenas moléculas bioativas como sondas para interrogar os mecanismos de desenvolvimento e 2) usando este modelo estabelecido para avaliar a atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados. Como conseqüência, o potencial de triagem do embrião da mosca tem sido subutilizada em caracterização de pequena atividade molécula.
Entrega de moléculas pequenas para o embrião da mosca pode ser alcançado com dois métodos: 1) permeabilização da casca do ovo e 2) de micro-injecção. Este artigo apresenta avanços ao método de permeabilização que são fáceis de executar no ambiente de um laboratório de Drosophila convencional. Deve notar-se que os avanços recentes nos métodos de microinjecção com tecnologia de microfluidos contribui também a métodos para a introdução de compostos para o 5,6 embrião. A introdução de moléculas para o embrião é impedida por uma camada de cera de casca do ovo 7. A casca de ovo Drosophila é composto por cinco camadas. A partir dedentro para fora que são: a membrana vitelina, a camada de cera, a camada interior coriónica, o endochorion eo Exocório 8. As três camadas coriônicos exteriores podem ser removidos através de uma breve emersão do embrião em diluída de lixívia, um passo designado por dechorionation. A camada de cera exposta pode ser comprometida por exposição a solventes orgânicos, tais como heptano, octano e 7,9, o que tornou o embrião dechorionated permeável, enquanto continua a ser envolto na membrana vitelina subjacente. No entanto, o uso desses solventes apresenta complicações devido a sua toxicidade ea dificuldade em regular a sua forte ação permeabilizante, sendo que ambos têm efeitos negativos sobre a viabilidade do embrião stark 9,10.
Um método de permeabilização usando uma composição denominada permeabilização embrião solvente (EPS) foi previamente descrito 1. Este solvente consiste de d-limoneno e derivados de plantas surfactantes que permitem que o solvente seja misciblenviar um e com tampões aquosos. A baixa toxicidade de d-limoneno e a capacidade para diluir o solvente para as concentrações desejadas produziu um método eficaz para gerar embriões permeáveis com uma alta viabilidade. No entanto, dois factores endógenos têm continuado a trazer limitações à aplicação. Primeiro, os embriões demonstram a heterogeneidade da permeabilidade após o tratamento EPS, mesmo quando o cuidado de manter uma estreita encenação de desenvolvimento. Em segundo lugar, os embriões mais velhos do que aproximadamente oito horas provaram difíceis de permeabilizar, de acordo com um endurecimento da casca do ovo que ocorre após a postura dos ovos, 11.
Descrito aqui estão os avanços no método EPS que: 1) auxiliar na identificação e análise de embriões quase idêntica permeabilizadas, mesmo após a fixação e positividade passos foram executados e 2) permitir a permeabilização de embriões no final momentos de desenvolvimento (> 8 horas, o estágio 12 e mais velhos). Especificamente, a aplicação de um corante vermelho distante,Ácido carboxílico CY5, está descrito que serve como um indicador da permeabilidade, que persiste no embrião em desenvolvimento, durante e após a sua fixação formaldeído. Além disso, mostra-se que a criação de embriões a 18 ° C mantém a casca de ovo num estado sensível EPS, permitindo a permeabilização de embriões de fase tardia (etapas 12-16).
Esses avanços superar as limitações mencionadas anteriormente à metodologia EPS. Esta aplicação irá, portanto, fornecer aos investigadores um meio para introduzir pequenas moléculas de interesse para o embrião em distintos momentos de desenvolvimento, mantendo a viabilidade.
O método acima descreve um meio para a obtenção de embriões viáveis de Drosophila, que são acessíveis para pequenos tratamentos da molécula através de uma gama ampla de desenvolvimento. Este método apresenta a nova e simples constatação de que o envelhecimento embriões a 18 ° C permite a permeabilização de embriões em estágio final com a mesma eficácia, como anteriormente visto apenas em embriões em estágio inicial. Além disso, a utilização do corante CY5 ácido carboxílico vermel…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
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