एक<em> पूर्व vivo</em> संस्कृति सिस्टम थायराइड विकास का अध्ययन करने के लिए
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
थायराइड थायराइड हार्मोन T3, टी -4, और कैल्सीटोनिन उत्पादन, गर्दन के आधार पर स्थानीयकृत एक bilobated अंत: स्रावी ग्रंथि है. कैल्सीटोनिन के रोम और रक्त केशिकाओं के एक घने नेटवर्क के बीच में interspersed सी कोशिकाओं, द्वारा संश्लेषित है जबकि T3 और T4, रोम बुलाया बंद क्षेत्रों में संगठित विभेदित thyrocytes, द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. वयस्क थायराइड वास्तुकला और कार्यों में बड़े पैमाने पर वर्णित है और अध्ययन किया गया है, "Angio-कूपिक" इकाइयों, पैरेन्काइमा में सी कोशिकाओं के वितरण और उपकला और endothelial कोशिकाओं के बीच पैराक्राइन संचार के गठन में अब तक समझा जा रहा से है.
इस विधि semiporous फिल्टर पर या माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक स्लाइड पर माउस भ्रूण थायराइड ANLAGEN विच्छेदन और अपनी संस्कृति के अनुक्रमिक चरणों का वर्णन है. चार दिन की अवधि के भीतर, इस संस्कृति प्रणाली ईमानदारी विवो थायराइड विकास में स्मरण दिलाता है. दरअसल, (मैं) अरबअंग की obation (E12.5 explants के लिए) तब होता है, (द्वितीय) व्यापारियों के रोम में संगठित करने और फूट डालना, (iii) thyrocytes और सी कोशिकाओं को अलग, और (iv) microdissected ऊतक पैदा में मौजूद endothelial कोशिकाओं, में विस्थापित thyrocytes वे vivo में कर के रूप में बारीकी से थायराइड पालियों, और, उपकला कोशिकाओं के साथ सहयोगी.
थायराइड ऊतकों जंगली प्रकार, पीटा या फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, immunostaining और RT-qPCR द्वारा पूर्व vivo विकास वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा सकता है. संस्कृति एंटीबॉडी, वृद्धि कारक है, या यहां तक कि कोशिकाओं या वातानुकूलित माध्यम अवरुद्ध, inhibitors के अलावा द्वारा चालाकी से किया जा सकता है explants, या संस्कृति के किसी भी समय.
बहाव के पूरे माउंट के साथ या वर्गों इमेजिंग और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा थायराइड ओ के morphogenetic और भेदभाव की घटनाओं से छेड़छाड़ और अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है पर संयुक्त निष्कर्ष, थायराइड explant संस्कृति मेंrganogenesis.
Introduction
थायरॉयड ग्रंथि endothelial केशिकाओं के एक घने नेटवर्क से घिरा रोम बुलाया स्वतंत्र उपकला क्षेत्रों का एक संग्रह है. इस संगठन थायराइड समारोह की अनुमति देता है: endothelial केशिकाओं T3 और T4 हॉर्मोन संश्लेषण के लिए आवश्यक आयोडीन साथ thyrocytes, प्रदान, और पूरे शरीर को इन बाद वितरित. रोम और केशिकाओं के बीच में बिखरे हुए, सी कोशिकाओं 1 कैल्सीटोनिन hypocalcemic हार्मोन का उत्पादन. वयस्क थायराइड वास्तुकला और कार्यों में अच्छी तरह से जाना जाता है, थायराइड भ्रूण विकास (कूप गठन और भेदभाव) में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र अब तक समझा जा रहा से कर रहे हैं.
Embryogenesis दौरान, (सी कोशिकाओं पूर्वज छोटी बूंद के आकार का उभार के रूप में E11.5 पर उत्पन्न जबकि पूर्वज भ्रूण दिन में अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर के उदर दीवार का एक मोटा होना (midline मूलरूप) (ई) माउस भ्रूण में 8.5, के रूप में निकलती है thyrocytes ultimobranchial बोचौथे ग्रसनी पाउच 2-6 की) मर जाता है. midline कली तो, अन्तर्जनस्तर से detaches श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर ultimobranchial निकायों के साथ E13.5 पर फ्यूज करने के लिए द्विपक्षीय फैलता है. अंत में, thyrocytes रोम में संगठित करने और सी कोशिकाओं को अलग.
थायराइड गठन पर वर्तमान ज्ञान मुख्य रूप से तय ऊतकों के histological विश्लेषण से आता है, लेकिन थायराइड गठन में शामिल morphogenetic घटनाओं अत्यधिक गतिशील हैं और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच और बाह्य मैट्रिक्स के साथ संचार और बातचीत शामिल है. हाल ही में काम thyrocyte progenitors विकासशील थायराइड के लिए endothelial कोशिकाओं की भर्ती के लिए VEGF के उच्च स्तर का उत्पादन, और बदले में, endothelial कोशिकाओं कूप गठन को बढ़ावा देने और सी कोशिकाओं के भेदभाव 7 भर्ती दिखाया.
थायराइड पर ज्यादातर पूर्व vivo अध्ययन या तो 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक डी पर हो, पृथक वयस्क थायराइड व्युत्पन्न कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया हैISHES या 3 डी matrices में. संस्कृतियों के इन प्रकार, विभेदित कूपिक कोशिकाओं polarized रहते हैं और रोम के रूप में संगठित या एक 3 डी संगठन 8-10 reacquire या तो उपयोग करना. हालांकि, उनके मनोवैज्ञानिक वातावरण से explanted, और 2 डी में सुसंस्कृत इन शुद्ध उपकला कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, साइटोकिन्स, वृद्धि कारकों के साथ और वे सामान्य रूप से विवो में मुठभेड़ कि ऐसे endothelial या नसों की कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ बातचीत की अनदेखी. एक बहुत अच्छा अध्ययन हाल ही में 3 डी Matrigel 11 में एक अंतिम संस्कृति कदम का उपयोग थायराइड के रोम में ES कोशिकाओं की एक भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन किया. हालांकि, इन 3 डी संस्कृतियों अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ संपर्क की कमी है.
अग्न्याशय और लार पर पिछले विशेषज्ञता के आधार पर अंग संस्कृति 12-14, माउस भ्रूण थायराइड ANLAGEN विदारक और semiporous फिल्टर पर या माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक स्लाइड पर explants संवर्धन के लिए एक विधि ग्रंथियों विकसित किया गया था.
जबE12.5 भ्रूण के साथ काम कर रहे, थायराइड ANLAGEN (midline मूलरूप और दो पार्श्व ultimobranchial निकायों) की दोहरी मूल ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा के microdissection लगाया. इस ट्रेकिआ, लेकिन नहीं घेघा निहित, और arytenoid सूजन के लिए ऊपर ग्रसनी मेहराब धमनियों से बढ़ाया. फिल्टर पर सुसंस्कृत जब वे अभी भी एक संकीर्ण isthmus से जुड़े दो थायराइड पालियों, के लिए फार्म ultimobranchial निकायों के साथ फ्यूज जहां, midline मूलरूप, श्वासनली के प्रत्येक पक्ष पर laterally फैली हुई है.
संस्कृति में, उपकला कोशिकाओं को पैदा करना, रोम में संगठित करने और उनके मूल के आधार पर, thyrocytes और सी कोशिकाओं में अंतर. Microdissected ऊतक में निहित Endothelial कोशिकाओं भी पैदा करना और अंत में स्वतंत्र रूप से रक्त प्रवाह या परिसंचारी कारकों की उपकला कूपिक संरचना, के साथ मिलकर संबद्ध करने के लिए थायराइड पालियों आक्रमण. Explants के विकास के लिए ईमानदारी से विकसित विवो में स्मरण दिलाता रूपजाहिर है, इस संस्कृति प्रणाली morphogenetic और थायराइड विकास के दौरान होने वाली भेदभाव की घटनाओं का अध्ययन करने के इष्टतम है.
थायराइड ऊतकों जंगली प्रकार, पीटा या फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है, और संस्कृति प्रणाली घाटे और लाभ के समारोह के प्रयोगों के लिए उत्तरदायी है. अंत में, माइक्रोस्कोपी प्लास्टिक के बर्तन पर fluorescently लेबल थायराइड explants के समय चूक इमेजिंग बेहतर विवो में होते हैं कि कैनेटीक्स और morphogenetic आंदोलनों की निरंतरता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. समय चूक इमेजिंग पहले ही अग्न्याशय 15,16 या ureteric कली की 17 शाखाओं में बंटी morphogenesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र विदारक और थायराइड गठन के लिए प्रमुख जटिल घटनाओं का अध्ययन करने और बेहतर ढंग से समझने के क्रम में थायराइड explants (E12.5) या पालियों (E14.5) संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन करता है. कारण थायराइड ANLAGEN (midline मूलरूप औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengelé, B., Many, M. -. C., Gérard, A. -. C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -. C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -. C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
