<em> 예 생체 내</em> 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
갑상선은 갑상선 호르몬 T3, T4, 그리고 칼시토닌을 생산, 목의 기지에서 지역화 bilobated 내분비 선입니다. 칼시토닌은 모공과 모세 혈관의 밀도가 네트워크 사이에 산재 C-세포에 의해 합성되는 동안 T3와 T4는 여포라는 폐쇄 된 분야로 구성 차별화 thyrocytes에 의해 생성된다. 성인 갑상선 아키텍처 및 기능은 광범위하게 기술되고 연구되어 왔지만, "angio-모낭"단위, 실질에서 C-세포의 분포 및 상피와 내피 세포 사이의 주변 분비 통신의 형성은 작게 이해되는 것이다.
이 방법은 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN 해부와 문화의 순차적 단계를 설명합니다. 사일의 기간 내에,이 배양 시스템은 생체 충실히 갑상선 발달 되풀이되었습니다. 사실, (I) 억원기관의 obation는 (E12.5 외식을 위해)가 발생, (II) 전구체는 여포로 구성하고 극화 (III) thyrocytes와 C-세포가 분화하고, (ⅳ) microdissected 조직의 증식에 존재하는 내피 세포가로 마이그레이션 thyrocytes 그들은 생체 내에서와 마찬가지로 밀접하게 갑상선 엽 (叶), 그리고, 상피 세포와 연결합니다.
갑상선 조직은 야생형, 녹아웃 또는 형광 유전자 변형 배아에서 얻을 수 있습니다. 또한, 면역 염색 및 RT-qPCR에 의해 생체 외 개발이 실시간으로 분석 할 수있다. 문화 항체, 성장 인자, 또는 세포 또는 배양 상청을 차단 억제제의 첨가에 의해 조작 될 수 이식편 또는 배양 언제든지.
하류 전체 마운트 또는 섹션 이미징 및 유전자 발현 프로파일 링 갑상선 O의 형태 형성과 분화 사건을 조작하고 공부를위한 강력한 시스템을 제공에 결합 된 결론, 갑상선 이식편 문화rganogenesis.
Introduction
갑상선 내피 모세 혈관의 밀도가 네트워크에 둘러싸여 여포라는 독립적 인 상피 분야의 모음입니다. 이 조직은 갑상선 기능 수 : 내피 모세관은 T3와 T4 호르몬 합성에 필요한 요오드와 thyrocytes를 제공하고, 몸 전체에 후자를 배포 할 수 있습니다. 모공과 모세 혈관 사이에 흩어져, C-세포는 1 칼시토닌 hypocalcemic 호르몬을 생산하고 있습니다. 성인 갑상선의 구조와 기능이 잘 알려져 있지만, 갑상선 배아 발달 (뿌리의 형성과 분화)에 관련된 세포 및 분자 메커니즘은 지금까지 이해되지 있습니다.
배 발생시, (C-세포의 전구 세포는 물방울 모양의 돌기로 E11.5에서 시작하는 동안 조상이 배아 일에 foregut의 내배엽의 복부 벽의 비후 (중간 선 anlage) (E) 마우스 배아에서 8.5으로 유래 thyrocytes ultimobranchial 보네 번째 인두 낭 2-6) 죽는다. 중간 선 봉오리는, 내배엽에서 분리 기관의 각 측면에 ultimobranchial기구와 E13.5에서 융합 양측으로 확장됩니다. 마지막으로, thyrocytes는 여포로 구성하고 C-세포는 분화.
갑상선 형성에 대한 현재의 지식은 주로 고정 된 조직의 조직 학적 분석을 제공하지만 갑상선 형성에 관여 형태 발생 이벤트는 매우 동적이며 다른 종류의 세포 사이의 세포 외 기질 (extracellular matrix)과의 통신 및 상호 작용을 포함한다. 최근 작품은 thyrocyte 전구 세포가 개발 갑상선에 내피 세포를 보충하는 VEGF의 높은 수준을 생산하고, 차례 차례로, 내피 세포가 모낭의 형성을 촉진하고 C-세포의 분화 7 모집 것으로 나타났다.
갑상선에있는 대부분의 생체 연구는 어느 차원 조직 배양 플라스틱 D에게 성장, 고립 된 성인의 갑상선 유래 세포에 수행 된ishes 또는 3D 행렬에. 문화의 이러한 유형의 차별화 된 모낭 세포 편광 유지하고 여포로 구성하거나 3D 조직 8-10을 다시 가져 오기를 사용하여. 그러나, 그들의 생리적 환경에서 외식 및 2D에서 배양 이러한 순수 상피 세포는, 세포 외 기질, 시토 킨, 성장 인자와 함께 그들이 일반적으로 생체 내에서 발생할 같은 내피 또는 신경 세포와 같은 다른 세포 유형의 상호 작용을 무시한다. 아주 좋은 연구는 최근 3 차원 매트 리겔 (11)에서 최종 배양 단계를 사용하여 갑상선 여포에 ES 세포의 분화 프로토콜을 설명했다. 그러나, 이러한 3 차원 배양은 다른 세포 유형과의 접촉이 부족하다.
췌장과 타액에 대한 이전의 전문 지식을 바탕으로 기관 배양 12-14, 마우스 배아 갑상선 ANLAGEN을 해부하고 semiporous 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드에 외식을 배양하는 방법을 동맥이 개발되었다.
언제E12.5 배아 작업, 갑상선 ANLAGEN (중간 선 anlage 두 측면 ultimobranchial 기관)의 이중 기원은 조직의 큰 조각의 미세 절제를 부과했다. 이것은 기관 아니지만 식도를 포함하고, 조각으로 부서져 종기까지 인두 아치 동맥으로부터 연장. 필터상에서 배양하면 그들은 여전히 좁은 지협에 의해 접속이 갑상선 돌출부를 형성하도록 ultimobranchial 체와 융합 여기서 정중선 anlage은 기관의 각 측면에 횡 방향으로 연장된다.
문화, 상피 세포 증식, 모낭에 정리하고 자신의 기원에 따라 thyrocytes와 C-세포로 분화. microdissected 조직에 포함 된 내피 세포는 증식하고 마지막으로 독립적으로 혈액의 흐름 또는 순환 요인의 상피 모낭 구조와 밀접하게 연관 갑상선 엽 (叶)에 침입. 외식의 개발은 충실하게 개발 생체 내에서 되풀이되었습니다으로, 표준이 문화 시스템은 형태 발생과 갑상선 개발 과정에서 발생하는 차별 사건을 연구하기에 최적입니다.
갑상선 조직은 야생형 녹아웃 또는 형광 형질 전환 배아로부터 수득 될 수 있고, 배양 시스템은 손실 및 기능 획득 실험 의무이다. 마지막으로, 현미경 플라스틱 접시에 형광 표지 갑상선 외식의 시간 경과 영상은 더 나은 생체 내에서 발생하는 반응 속도와 형태 형성 운동의 연속성을 조사하기 위해 악용 될 수 있습니다. 시간 경과 영상은 이미 췌장 15, 16 또는 ureteric 버드 (17)의 분기 형태 형성을 연구하는 데 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 해부 갑상선 형성으로 이어지는 복잡한 이벤트를 공부하고 더 잘 이해하기 위해 갑상선 외식 (E12.5) 또는 돌출부 (E14.5)를 배양하는 방법을 설명합니다. 인해 갑상선 ANLAGEN (정중선 anlage 및이 횡 ultimobranchial 체), 및 그 작은 크기, 인두 아치 동맥 E12.5 조직 지역화 주동이의 단편, 및 기관을 포함하는, 그러나 식도의 이중 원점 microdissected 있습니다. 도시 된 바와 같이, 사일의 기간 내에,이 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
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