Bir<em> Ex vivo</em> Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması
Summary
This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.
Abstract
Tiroid tiroid hormonları T3, T4 ve kalsitonin üreten, boyun tabanında lokalize bir bilobated endokrin bezdir. Kalsitonin foliküllerinin ve kan kılcal yoğun bir ağ arasına serpiştirilmiş C-hücreleri tarafından sentezlenen ise T3 ve T4, folikül adlandırılan kapalı alanlarda düzenlenmiş farklı tirositlerin, tarafından üretilmektedir. Yetişkin tiroid mimari ve fonksiyonlar, kapsamlı olarak tarif ve incelenmiştir edilmiş olmasına rağmen, "anjiyo-foliküler" birimleri, parankimasında C-hücrelerinin dağılımı ve epitelyal ve endotelyal hücreleri arasındaki iletişimin parakrin oluşumu uzak anlaşılmalıdır değil.
Bu yöntem yarı macunsu filtrelerinde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde fare embriyonik tiroid anlagen diseksiyon ve kültürünün sıralı adımları açıklar. Dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadakatle vivo tiroid geliştirme tartışıldı. Gerçekten de, (i) bilorganın obation (E12.5 eksplantlar için) ortaya çıkar, (ii) ön-maddeleri foliküllerine düzenlemek ve polarize, (iii) tirositler ve C-hücreleri ayırt eder, (iv) microdissected proliferatif doku içinde mevcut endotel hücreleri, içine göç tirositler Onlar in vivo gibi yakından tiroid lobları, ve, epitel hücreleri ile ilişkilendirmek.
Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir. Dahası, immün ve RT-qPCR ile Ex vivo gelişimi gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Kültür antikorlar, büyüme faktörleri, ya da hücreler ya da şartlandırılmış ortam engelleme, inhibitör ilavesiyle manipüle edilebilir eksplant ya da kültürün her zaman.
Aşağı bütün-mount veya bölümleri görüntüleme ve gen ekspresyon profili tiroid o bir morfogenetik ve farklılaşma olayları manipüle ve eğitim için güçlü bir sistem sağlar üzerinde kombine sonuç, tiroid eksplant kültürü içinderganogenesis.
Introduction
Tiroid bezi endotel kılcal damarların yoğun bir ağ ile çevrili folikül denilen bağımsız epitel küreler bir bütünüdür. Bu örgüt, tiroid fonksiyon verir: endotel kapilerler T3 ve T4 hormon sentezi için gerekli olan iyot ile tirositler sağlamak, ve tüm vücuda bu son dağıtmak. Foliküllerinin ve kılcal arasında dağınık, C-hücreleri 1 kalsitonin Hipokalsemik hormonu üretir. Erişkin tiroid mimarisi ve fonksiyonları iyi bilinmesine rağmen, tiroid embriyonik gelişim (folikül oluşumu ve farklılaşma) dahil hücresel ve moleküler mekanizmalar çok anlaşılır olmaktan vardır.
Embriyojenez sırasında, (Cı-hücrelerinin ataları damla şeklinde çıkıntılar olarak E11.5 de kaynaklanan sırasında projenitör embriyonik gün foregut endoderm ventral duvarının kalınlaşması (orta hat anlage) (e) fare embriyo 8.5, olarak çıkar tirositler ultimobranchial boDördüncü faringeal torbalar 2-6) ölür. Orta hat tomurcuk daha sonra, endoderm ayrılır trakea her tarafında ultimobranchial organları ile E13.5 kaynaştırmak için bilateral genişler. Son olarak, tirositler foliküllerinin düzenlemek ve C-hücreleri ayırt.
Tiroid oluşumu üzerinde akım bilgisi temel olarak sabit dokuların histolojik analiz gelmektedir, ancak tiroid oluşumunda rol oynayan morfojenik olaylar yüksek dinamik ve farklı hücre tipleri arasında ve hücre dışı matris ile iletişimi ve etkileşimleri içerir. Son çalışmalar tirosit progenitorlar gelişmekte olan tiroid endotel hücrelerini işe VEGF'nin yüksek düzeylerde üretilmesi, ve buna bağlı olarak, endotel hücreleri folikül oluşumunu teşvik etmek ve C-hücrelerinin farklılaşma 7 işe gösterdi.
Tiroid üzerinde en ex vivo çalışmalar hem 2D doku kültürü plastik d yetişen, izole erişkin tiroid kaynaklı hücreler üzerinde yapılmıştırishes veya 3D matrislerde. Bu tür kültürlerin, farklılaşmış foliküler hücreleri polarize kalır ve folikül olarak düzenlenen veya 3D organizasyon 8-10 reacquire kullanarak. Ancak, fizyolojik bir ortamda eksplante ve 2D kültürlenmiş, bu saf epitel hücreler, hücre dışı matris, sitokinler, büyüme faktörleri ve normal olarak in vivo olarak karşılaştıkları gibi endotel veya sinir hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile etkileşimi yok sayar. Çok güzel bir çalışma, son zamanlarda 3D matrigel 11 bir son kültür adımı kullanarak tiroid foliküllerinin ES hücrelerinin bir farklılaşma protokol nitelendirdi. Bununla birlikte, bu 3D kültürler diğer hücre tipleri ile temas yoksundur.
Pankreas ve tükrük önceki uzmanlığa dayalı bir organ kültürü 12-14, fare embriyonik tiroid Anlagen diseksiyon ve yarı macunsu filtrelerde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde eksplantlarm için bir yöntem bezleri geliştirilmiştir.
Ne zamanE12.5 embriyolar ile çalışan tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ikili kökeni dokusunun büyük bir parçasının mikrodiseksiyon empoze. Bu trakea, ancak yemek borusu bulunan ve aritenoid şişme kadar faringeal kemer arterlerden uzatıldı. Filtreler üzerinde kültürlenmiştir zaman yine de dar bir kıstak tarafından bağlanan iki tiroid lobları, meydana getirmek üzere ultimobranchial organlarla sigorta burada, orta hat Anlage, trakea her iki tarafına yatay olarak uzanır.
Kültüründe, epitel hücreler çoğalmaya folikül halinde organize ve kaynağına bağlı olarak, tirositlerin ve C-hücreleri içinde farklılık gösterir. Microdissected dokusunda bulunan endotel hücreleri çoğalır ve son olarak da, bağımsız bir şekilde kan akışının veya dolaşan faktörlerin foliküler epitel yapısı ile yakından ilişkilendirmek için tiroid lobları istila. Eksplantlarının gelişme sadakatle geliştirmek vivo özetlediği gibi,ment, bu kültür sistemi morfogenetik ve tiroid bezi gelişimi sırasında meydana gelen farklılaşma olayları incelemek için en uygunudur.
Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir, ve kültür sistemi kaybı-ve kazanç-fonksiyon deneyleri elverişlidir. Son olarak, mikroskopi plastik tabaklar üzerinde floresan etiketli tiroid eksplantlarının zaman atlamalı görüntüleme daha iyi in vivo meydana kinetik ve morfogenetik hareketlerin devamlılığını araştırmak için yararlanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme önceden pankreas 15,16 ya da 17 ureterik gonca arasında dallanma morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, kesme ve tiroid oluşumuna yol açan karmaşık olay çalışma ve daha iyi anlamak amacıyla, tiroid eksplantlar (E12.5) ya da loblar (E14.5) kültürlenmesi için bir yöntem tarif etmektedir. Nedeniyle tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ve kendi küçük boyutu, yutak kemer arterlere E12.5 doku lokalize rostral bir parçası, ve trakea içeren, ancak yemek borusu ikili kökeni microdissected edilir. Gösterildiği gibi, dört günlük bir süre içinde, bu kültür…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by grants from the Université catholique de Louvain (Action de recherché concertées) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from Télévie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).
Materials
| µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile | proxylab | 80826 | |
| Collagen Type I, rat tail | Millipore | 08-115 | |
| Fibronectin from human plasma | Invitrogen | # 33010-018 | |
| M199 | Invitrogen | 31150-022 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | |
| Tungsten wire | Goodfellow | LS237450 | |
| culture plate insert (12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| E-cadherin | BD Biosciences | 610182 | 1/1000 |
| Ezrin | Thermo Scientific | MS-661-P1 | 1/400 |
| PECAM | BD Biosciences | 550274 | 1/100 |
| Hoechst | Sigma | B2261 |
References
- Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengelé, B., Many, M. -. C., Gérard, A. -. C. Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units. Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).
- Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation. Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenesis of the thyroid gland. Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).
- Fagman, H., Nilsson, M. Morphogenetics of early thyroid development. J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms. Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).
- De Felice, M., Di Lauro, R. Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update. Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).
- Hick, A. -. C., et al. Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation. Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).
- Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering. Endocr. J. 48, 407-425 (2001).
- Toda, S., et al. Culture models for studying thyroid biology and disorders. ISRN Endocrinol. , (2011).
- Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo. 213, 47-58 (2003).
- Antonica, F., et al. Generation of functional thyroid from embryonic stem cells. Nature. 491, 66-71 (2012).
- van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A. J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).
- Hick, A. -. C., et al. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9. , (2009).
- Pierreux, C. E., et al. Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , (2012).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro. Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).
