Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub> F</sub>) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel
Summary
Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) av celler kan bidra til å forstå reguleringsmekanismene av aquaporins (AQPs). P f bestemmelse in sfæriske plantecelleprotoplaster som er presentert her omfatter protoplaster isolasjon og numerisk analyse av sin opprinnelige hastighet på volumendring som et resultat av en osmotisk utfordring under konstant bad perfusjon.
Abstract
Studerer AQP reguleringsmekanismer er avgjørende for forståelsen av vannforhold både på mobilnettet og hele plante nivåer. Presenteres her er en enkel og svært effektiv metode for bestemmelse av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) i planteprotoplaster, gjelder i prinsippet også for andre sfæriske celler som froskeoocytter. Det første trinnet av analysen er den isolering av protoplaster fra plantevevet av interesse ved enzymatisk fordøyelse inn i et kammer med et passende isotonisk oppløsning. Det andre trinnet består av en osmotisk utfordring assay: protoplaster immobilisert på bunnen av kammeret sendes til en konstant perfusjon starter med en isotonisk oppløsning og etterfulgt av en hypoton løsning. Cellen hevelse er video spilt. I det tredje trinnet, blir bildene behandlet frakoblet, hvorved volumendringer, og tidsforløpet for volumendringer er korrelert med tidsforløpet av endringen i osmolahet av kammeret perfusjon medium, ved hjelp av en kurvetilpasningsprosedyre skrevet i Matlab (den "PfFit '), for å gi P f.
Introduction
Vannopptak og strømmen over cellemembraner er en grunnleggende forutsetning for anleggs eksistens på både den cellulære og hele anlegget nivåer. På cellenivå, aquaporins (AQPs) spiller en sentral rolle i reguleringen av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P f) i cellemembranen 1-3.
Hittil har flere metoder vært ansatt i å måle den endogene P f av protoplast fra forskjellige plante organer (dvs. røtter, mesophyll, endodermis, etc., Anmeldt av Chaumont et al. 4). En av fremgangsmåtene for å måle P f er å eksponere de protoplaster til en osmotisk utfordring og å overvåke den første frekvensen av den volumendring (dvs.., Helningen av den tidlige lineære fase av volumendring). To forskjellige metoder ble tidligere beskrevet basert på denne fremgangsmåten, begge basert på en umiddelbar utveksling av løsninger. Den første består av immobilizing av protoplast med en suge mikropipette og svitsjing væsketilførselen 5 og den andre for overføring av protoplast fra en oppløsning til en annen ved hjelp av en mikropipette 6. Disse mikropipette sug og Mikropipette overføring metoder, som tillater image oppkjøpet helt i starten av den raske løsningen utveksling (for å fange opp tidlig lineær fase av volumendring), sannsynligvis innebære en fysisk stress til protoplaster og krever spesialisert utstyr og ekspert micromanipulation.
Metoden som beskrives her minimaliserer forstyrrelsen til cellene, innebærer ingen mikro-manipulering og tillater avledning av P f når badekaret perfusjon er ikke umiddelbar.
Etter den enzymatiske fordøyelse, proto, neddykket i en isotonisk oppløsning, blir immobilisert på dekkglass bunnen av en pleksiglass (aka Lucite eller perspex) kammeret ved charge interaksjon. Deretter, i løpet av en konstant bad perfusjonden isotonisk oppløsning spyles bort av en hypoton løsning for å generere et hypoosmotic utfordring til protoplaster. Den svelling av protoplasten er video registrert og deretter, ved å kombinere informasjonen om tidsforløpet for badekaret perfusjon og tidsforløpet av cellen svelling, er P f bestemt ved bildeprosessering, og kurvetilpasningsprosedyrer.
Fordelene ved denne metode er at forsøket er meget effektiv, dvs. det er mulig å overvåke et par celler samtidig i en enkelt analyse, og at den ikke krever spesielt utstyr eller spesielle mikromanipulasjons ferdigheter. Flere anvendelser av denne fremgangsmåte er mulig. For eksempel bestemmelse av native P f av et utvalg av celler fra forskjellige vev og planter, slik som mesophyll og bunt kappe celler fra Arabidopsis, blad 7, mais blad mesophyll eller rot-cortex-celler 8-10 eller suspensjon dyrkede celler 11,12. I additividere, er det mulig å bestemme P f av sfæriske dyreceller slik som oocytten celler 11. Et annet eksempel innebærer undersøkelse av AQP aktivitet ved forbigående uttrykk for sin genet i proto (eller noen andre gener som kan påvirke dem, for eksempel, gener kinaser) og fastsettelse av deres bidrag til P f; for eksempel uttrykk for tomat AQP SlTIP2; 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster av PEG transformasjon og besluttsomhet den SlTIP2; to-relaterte P f 13. Endelig undersøkelse av effekten på P f av forskjellige molekyler / stoffer (legemidler, hormoner, etc.) tilsatt til løsningene kan også bli undersøkt, for eksempel på den AQP blokkering HgCl 2 7.
Den følgende protokoll beskriver isolering av protoplaster fra Arabidopsis mesophyll celler og bestemmelse av deres P f.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er en enkel og meget effektiv fremgangsmåte for å måle P f av isolerte planteprotoplaster, som gjelder i prinsippet også for andre sfæriske celler, f.eks., Froskeoocytter 11. Denne metoden er basert på måling av P f i respons til en osmotisk utfordring til cellen. I motsetning til andre metoder basert på denne tilnærmingen er imidlertid endringen av løsninger, dvs. av osmolariteten, er ikke øyeblikkelig, men gradvis, i løpet av en konstant bad …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det belgiske nasjonale fondet for vitenskapelig c forskning (FNRS), Interuniversity attraksjon polakker Programme-belgiske forskningspolitikk og "Communauté française de Belgique-Actions de RECHERCHES Concertées" til FC, fra Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) til MM (Grant # 1311-1312), og til NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
